微生物檢驗(yàn)常見問題解答

　　微生物包括：細(xì)菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、顯微藻類等在內(nèi)的一大類生物群體，它個(gè)體微小，與人類關(guān)系密切。以下是小編為大家收集的微生物檢驗(yàn)常見問題解答，僅供參考，歡迎大家閱讀。

　　一、方法驗(yàn)證

　　1.做過驗(yàn)證的樣品微生物檢驗(yàn)方法是否都需要按照新的方法進(jìn)行重新驗(yàn)證？

　　答：對(duì)于微生物限度檢查的產(chǎn)品而言，由于培養(yǎng)時(shí)間調(diào)整，應(yīng)重新進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)于無菌檢查的產(chǎn)品而言，如果方法未作實(shí)質(zhì)性調(diào)整，可以不必重新驗(yàn)證。個(gè)別產(chǎn)品在各論中收載了新的無菌檢查方法，對(duì)這些品種，應(yīng)對(duì)收載方法的適用性進(jìn)行驗(yàn)證。

　　2.以前做過無菌驗(yàn)證的品種是否需要重新按照新的標(biāo)準(zhǔn)再驗(yàn)證？

　　答：參見問題1。

　　3.“新增抗生素供試品應(yīng)選擇低吸附的濾器及濾膜”比如注射用克林霉素磷酸酯屬于抗生素，是否需要重新選取濾膜再驗(yàn)證？

　　答：目前采用的方法如果經(jīng)驗(yàn)證表明可行，則可以繼續(xù)使用該方法。

　　4.微生物方法學(xué)驗(yàn)證時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間是否跟樣品日常檢驗(yàn)所培養(yǎng)時(shí)間一致？

　　答：應(yīng)該一致。

　　5.微生物限度驗(yàn)證時(shí)，如果一個(gè)方法只有金葡回收率達(dá)不到要求，該方法時(shí)是否可以用來做細(xì)菌霉菌的檢測(cè)方法？

　　答：按藥典的規(guī)定，一個(gè)計(jì)數(shù)方法通過驗(yàn)證，是指所有試驗(yàn)菌的回收率均達(dá)到要求。如果采用各種方法以及方法的組合仍無法使金葡回收率達(dá)標(biāo)，則可以采用使金葡回收率最高的方法作為計(jì)數(shù)方法。

　　6.薄膜過濾的沖洗量不能超過1000ml，我公司的喹諾酮類產(chǎn)品原來的方法是每張膜沖洗量為1500和2000ml，請(qǐng)問有沒有合適的方法將沖洗量降至1000，各菌的回收率仍能符合規(guī)定？

　　答：有幾種辦法可以降低沖洗劑的用量：

　　1)降低接觸濾膜的供試品的濃度;

　　2)改進(jìn)沖洗的方式，如少量多次地沖洗、降低蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速等;

　　3)添加中和劑，如高價(jià)金屬離子。

　　7.微生物限度檢查法規(guī)定，技術(shù)方法驗(yàn)證時(shí)，采用上述方法若還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收率達(dá)不到要求，那么選擇回收率最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品檢驗(yàn)。請(qǐng)問，上述方法是指僅通過一種方法還是一定要通過幾種方法聯(lián)用的？

　　答：應(yīng)該要把可能采用的所有方法包括方法聯(lián)用都進(jìn)行驗(yàn)證。

　　8.供試品不溶于稀釋劑，同時(shí)又有抑菌性，限度檢查時(shí)應(yīng)如何消除抑菌性？

　　答：采用低速離心的方式，盡可能把供試品去除干凈，取離心后的上層液，進(jìn)行薄膜過濾。

　　9.不溶于水的固體產(chǎn)品，加表面活性劑后，如何操作才能在方法驗(yàn)證中得到較好的回收率？

　　答：同問題8。

　　10.有些品種2010年藥典與2005年比較檢驗(yàn)方法變了，是否需要驗(yàn)證或確認(rèn)？

　　答：同問題1。

　　二、菌種管理

　　1.濃菌液的有效期該如何確定？

　　答：藥典沒有規(guī)定�？梢酝ㄟ^實(shí)驗(yàn)確定有效期。例如，在不同的時(shí)間點(diǎn)測(cè)定濃菌液的濃度，從而判斷其有效期。

　　2.藥典要求菌液在制備后2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在2-8℃的菌懸液可在在24小時(shí)內(nèi)使用，那我們?cè)谧鲵?yàn)證或陽(yáng)性對(duì)照是要加一定量的菌就沒有時(shí)間進(jìn)行平板計(jì)數(shù)了，該如何確保所加菌量準(zhǔn)確？

　　答：藥典對(duì)稀釋菌液的使用期限作出規(guī)定，并不會(huì)影響操作過程中稀釋菌液的加入。即便不規(guī)定，也無法在準(zhǔn)確知道菌液濃度的情況下加入試驗(yàn)菌。菌液稀釋的實(shí)驗(yàn)操作和加入菌液的實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)該是在同一次實(shí)驗(yàn)中完成的，要使加入的菌量符合藥典的規(guī)定，可以從濃菌液的制備方法、菌液稀釋的方法等方面進(jìn)行規(guī)范，也可以引入濁度比較的方法。

　　3.菌懸液能否在倒平板之前確定菌含量？

　　答：活菌含量是無法確定的�？偩�量可以通過比濁的方式確定。

　　4.具體從哪些方面進(jìn)行菌種菌株的特性和純度確認(rèn)？如何操作？

　　答：基層的微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行菌種純度確認(rèn)可以考慮以下一些方面：1)形態(tài)學(xué)鑒定，包括菌落形態(tài)和染色形態(tài);2)生化鑒定，可以考慮使用API鑒定系統(tǒng)。

　　5.黑曲霉凍干菌種如何轉(zhuǎn)種，傳代？

　　答：與其他菌種一樣，所不同的是使用的培養(yǎng)基應(yīng)改為改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基。

　　6.干粉狀的是否可做第0代使用？

　　答：只要是菌種保藏機(jī)構(gòu)提供的凍干保藏的菌種，可以確定為第0代。

　　7.菌種每次傳代都要做純度、特性等的確認(rèn)嗎？

　　答：從外部購(gòu)入的菌種，在進(jìn)入本實(shí)驗(yàn)室的菌種保藏體系時(shí)，需要進(jìn)行純度和特性的確認(rèn)。以后的每次傳代，可以通過顯色培養(yǎng)基做簡(jiǎn)單的確認(rèn)即可。

　　8.如采用低溫保存菌種，需購(gòu)買哪些設(shè)備？能夠到省所進(jìn)行實(shí)際操作培訓(xùn)？

　　答：低溫冰箱，應(yīng)能夠提供-70℃的低溫。可以到省所來培訓(xùn)。

　　9.做方法驗(yàn)證時(shí)，工作用菌種能否同時(shí)操作，如何防止交叉污染？

　　答：可以同時(shí)操作。避免交叉污染的關(guān)鍵是無菌操作技術(shù)。

　　10.是否等菌懸液的含菌數(shù)出結(jié)果后再做適用性等檢查？

　　答：沒有必要�？蓞⒁妴栴}2。

　　11.菌液制備中菌液是否都要驗(yàn)證儲(chǔ)存期？

　　答：稀釋菌液可參考藥典規(guī)定。如要保存濃菌液，則需要驗(yàn)證有效期。

　　12.菌種CMCC是否可以用ATCC替代，從省所或中檢所購(gòu)買的菌種是否每次都可以出具規(guī)范的COA？

　　答：中國(guó)藥典使用CMCC的菌種，并沒有規(guī)定可以使用其他等效的菌種。省所提供的菌種嚴(yán)格講屬于標(biāo)準(zhǔn)貯備菌種，無法提供ATCC這樣的COA。CMCC至今也無法提供這類證明。

　　13.銅綠假單胞如何保藏？答：可以使用低溫冷凍保存的方法。

　　14.工作用菌液是否屬于亞培養(yǎng)或傳代一次？

　　答：工作用菌液應(yīng)屬于一次傳代。

　　三、微生物限度

　　1.包裝材料的大腸埃希菌檢查？

　　答：根據(jù)包裝材料的不同，大腸埃希菌的檢查方法大致有兩種，一種是將浸提液合并后，取一部分，接種膽鹽乳糖培養(yǎng)基進(jìn)行檢查;另一種是將浸提液合并后，薄膜過濾，然后按規(guī)定的方法檢驗(yàn)。

　　2.抗真菌藥品的微生物限度檢查法

　　答：這類產(chǎn)品的霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法需要進(jìn)行調(diào)整，可以根據(jù)產(chǎn)品劑型的不同，選擇薄膜過濾法或培養(yǎng)基稀釋法等方法。

　　3.為什么在日常樣品檢測(cè)中還需要做陽(yáng)性對(duì)照(國(guó)外不需要)？

　　答：為了確保每一次檢測(cè)對(duì)可能存在的微生物都是有效的。

　　4.對(duì)于同一個(gè)品種，藥典為什么不規(guī)定統(tǒng)一的檢測(cè)方法？

　　答：本版藥典進(jìn)行過這樣的嘗試，也有某些品種已經(jīng)收載了統(tǒng)一的檢測(cè)方法，如注射用頭孢類抗生素的無菌檢查。之所以沒有大量收載，主要是由于檢測(cè)方法還沒有經(jīng)過必要的復(fù)核。將微生物檢驗(yàn)的統(tǒng)一方法收載在品種的各論項(xiàng)下，始終是努力的方向。

　　5.梭菌檢查中需置厭氧條件下培養(yǎng)48小時(shí)，是否指在厭氧培養(yǎng)箱中？

　　答：需要在厭氧培養(yǎng)裝置中進(jìn)行培養(yǎng)，未必一定是厭氧培養(yǎng)箱。

　　6.控制菌檢查方法驗(yàn)證時(shí)，采用多種方法均未檢出控制菌，如何處理？

　　答：在確保所使用的各種方法都沒有錯(cuò)誤的情況下，如果仍無法使試驗(yàn)菌生長(zhǎng)，則應(yīng)該采用薄膜過濾法進(jìn)行檢查。理由是該方法能夠最大程度地去除產(chǎn)品的抑菌作用。

　　7.常規(guī)的監(jiān)督抽樣檢品(包括原料)在進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，是否一定要進(jìn)行活螨檢查并在原始記錄與報(bào)告書中體現(xiàn)？

　　答：需要進(jìn)行檢查�？梢栽谠�始記錄中體現(xiàn)，報(bào)告書上可以不出現(xiàn)，除非當(dāng)發(fā)現(xiàn)有活螨檢出。

　　8.藥包材微生物限度檢查規(guī)定了合格質(zhì)量水平，通常產(chǎn)量下取樣8個(gè)，要求8個(gè)瓶子均符合規(guī)定，如何進(jìn)行？

　　答：每個(gè)瓶子分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

　　9.大腸埃希菌具體操作規(guī)程？

　　答：參見中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。

　　10.動(dòng)物組織及動(dòng)物類原藥材的提取物入藥，是否需要檢沙門菌？

　　答：需要進(jìn)行沙門菌檢查。

　　11.關(guān)于中國(guó)藥典菌落計(jì)數(shù)結(jié)果的判斷還存在疑義，望能舉例說明。

　　答：不清楚所指的存在疑義是指哪方面。2010年版對(duì)結(jié)果報(bào)告進(jìn)行了較大篇幅的修訂，目前的規(guī)定應(yīng)該比05版更為清晰、明確。

　　12.需做沙門菌檢驗(yàn)樣品量的確定？

　　答：10g(ml)用于樣品計(jì)數(shù)檢驗(yàn)和其他控制菌檢查，10g(ml)用于沙門菌檢查，10g(ml)用于沙門菌檢查的陽(yáng)性對(duì)照。需要進(jìn)行沙門菌檢查的樣品，檢驗(yàn)用量應(yīng)為30g(ml)。

　　13.日常的實(shí)驗(yàn)室裝備能否達(dá)到梭菌無氧的培養(yǎng)要求？

　　答：完全可以�？梢圆捎脜捬跖囵B(yǎng)盒(罐)。

　　14.如果一個(gè)產(chǎn)品有兩個(gè)規(guī)格，是否可以取其中之一做陽(yáng)性對(duì)照？

　　答：每個(gè)規(guī)格均需進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照。

　　15.細(xì)菌數(shù)為100g/g的，樣品稀釋級(jí)只做1:10,1:100的倍數(shù)就可以了嗎？

　　答：可以。

　　16.培養(yǎng)時(shí)間3天，5天，可理解為72小時(shí)，120小時(shí)嗎？

　　答：可以。這樣更為嚴(yán)謹(jǐn)。

　　17.中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范“已做驗(yàn)證試驗(yàn)的供試品，在檢查時(shí)刻不必再做陽(yáng)性對(duì)照”如何理解？

　　答：該標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范中在無菌檢查法中規(guī)定“供試品無菌檢查應(yīng)進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)”，表明不論是否進(jìn)行了方法驗(yàn)證，在產(chǎn)品的每一次檢驗(yàn)過程中，還必須進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照。在控制菌檢查的大腸埃希菌項(xiàng)下，指出“已做驗(yàn)證試驗(yàn)的供試品，在該供試品檢查時(shí)不必再作陽(yáng)性對(duì)照”。該規(guī)定僅適用方法驗(yàn)證與供試品檢查同時(shí)開展的情況。2005年版藥典和2010年版藥典在控制菌檢查中均對(duì)陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)有明確規(guī)定，“進(jìn)行供試品控制菌檢查時(shí)，應(yīng)做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)�！碑a(chǎn)品檢驗(yàn)中應(yīng)以藥典規(guī)定為準(zhǔn)。

　　18.無菌檢查和微生物限度檢查中，產(chǎn)品中規(guī)定的溶解液是否可以換成其他的溶液？

　　答：可以。

　　19.制劑通則中，沒有微生物檢查項(xiàng)目的，是否可不進(jìn)行微生物項(xiàng)目檢測(cè)？

　　答：可以。主要是二部制劑通則中口服片劑、膠囊劑、丸劑和顆粒劑。

　　20.在細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)中，適用性檢查細(xì)菌是培養(yǎng)48小時(shí)，霉菌和酵母菌是培養(yǎng)72小時(shí)，供試品檢查中細(xì)菌是培養(yǎng)3天，霉菌和酵母菌是培養(yǎng)5天，那方法驗(yàn)證中應(yīng)參照哪個(gè)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)。

　　答：應(yīng)按照供試品檢驗(yàn)時(shí)的條件，即細(xì)菌3天，霉菌和酵母菌5天。

　　21.測(cè)定純化水微生物限度時(shí)，每張濾膜過濾量是多少合適？需要先稀釋嗎？過濾完后需不需要沖洗？假如我取10ml純化水通過雙杯體封閉式薄膜過濾器過濾，每張濾膜上的計(jì)數(shù)是以5ml為單位還是10ml為單位？

　　答：過濾量應(yīng)以培養(yǎng)后出現(xiàn)的微生物數(shù)不超過100cfu/膜為標(biāo)準(zhǔn)。一般可不稀釋。不需要沖洗。每張濾膜的過濾量為5ml。

　　22.2010藥典中關(guān)于純化水的微生物限度是：細(xì)菌、霉菌及酵母菌總數(shù)每1ml不得過100個(gè)。這句話的意思是細(xì)菌總數(shù)每1ml不得過100個(gè)，霉菌及酵母菌總數(shù)不得過100個(gè)，還是細(xì)菌+霉菌+酵母菌總數(shù)每1ml不得過100個(gè)。如果是三者總數(shù)的話，那細(xì)菌總數(shù)限度是多少？霉菌及酵母菌總數(shù)限度又是多少？

　　答：是總數(shù)不得過100個(gè)。沒有必要考慮各自的限度值。

　　拓展閱讀：微生物檢驗(yàn)的名詞解釋大全

　　微生物：是一群個(gè)體微小 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單 肉眼不能看見的微小生物的總稱

　　種：親緣關(guān)系較近的微生物群體 在進(jìn)化發(fā)育階段上有一定的共同形態(tài)和生理特征

　　微生物學(xué)：生物學(xué)的一個(gè)分支 是研究微生物在一定條件下的形態(tài)結(jié)構(gòu) 生理生化遺傳變異特性及微生物的進(jìn)化 分類 生態(tài)等生命活動(dòng)規(guī)律以及微生物之間 與人類 動(dòng)植物 自然界互相關(guān)系的一門科學(xué)

　　抗生素：是由某些微生物在代謝過程中產(chǎn)生的 能抑制或殺滅某些其他微生物和腫瘤細(xì)胞的微量生物活性物質(zhì)

　　細(xì)菌素：是某些細(xì)菌菌株產(chǎn)生的一類具有抗菌作用的蛋白質(zhì)

　　條件致病菌：正常菌群在宿主體內(nèi)具有相對(duì)穩(wěn)定性 一般不致病

　　消毒：指殺死物體上的病原微生物但不一定能殺死細(xì)菌芽孢的方法

　　滅菌：指殺滅物體上所有的微生物的方法

　　防腐：指防止或抑制微生物生長(zhǎng)繁殖的方法

　　無菌：指沒有貨的微生物的存在

　　質(zhì)粒：是細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì) 也是環(huán)狀閉合的雙聯(lián)DNA分子 比染色體小 存在于細(xì)胞質(zhì)中 可自主復(fù)制

　　突變：是指細(xì)菌遺傳物質(zhì)的機(jī)構(gòu)發(fā)生突然而穩(wěn)定的改變 所致的變異現(xiàn)象可遺傳給后代 基因轉(zhuǎn)移：外源性物質(zhì)由供體菌轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞內(nèi)的過程

　　基因重組：供體菌的基因進(jìn)入受體菌細(xì)胞 并在其中自行復(fù)制與表達(dá) 或矛受體菌DNA整合在一起的過程

　　病毒：是一類個(gè)體微小 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單 只含一種核酸 只能在活的易感細(xì)胞內(nèi)以復(fù)制方式增殖的非細(xì)胞型微生物

　　復(fù)制周期：病毒的增殖被人為分成吸附 穿入 脫殼 生物合成 裝配 成熟與釋放七個(gè)步驟的完整過程

　　缺陷病毒：是指因病毒基因組不完整或因基因某一點(diǎn)改變而不能進(jìn)行正常增殖的病毒 頓挫感染：病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞 若細(xì)胞缺乏病毒復(fù)制所需的酶 能量和必要成分等 則病毒無法合成自身成分不能夠裝配和釋放子代病毒的現(xiàn)象

　　干擾現(xiàn)象：兩種病毒感染同一種細(xì)胞時(shí) 可發(fā)生一種病毒抑制另一種病毒增殖的現(xiàn)象 人工自動(dòng)免疫：是將疫苗等免疫原接種于人體 刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答 使機(jī)體獲得特異性免疫力

　　人工被動(dòng)免疫：是指注射含某種病毒特異性中和抗體的免疫血清等一系列細(xì)胞因子 是機(jī)體立即獲得特異性免疫

　　干擾素：是由病毒或干擾素誘生劑作用于中性粒細(xì)胞 成纖維細(xì)胞或免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一種糖蛋白

　　致病性：一定種類的病原微生物 在一定的條件下能在特殊的宿主體內(nèi)引起特定疾病的能力 半數(shù)致死量：在規(guī)定時(shí)間內(nèi) 通過一定途徑 能使一定體重或年齡的某種動(dòng)物半數(shù)死亡或感染需要的最小病原體數(shù)量或毒素量

　　急性感染：發(fā)作突然 病程較短 一般是數(shù)天或數(shù)周

　　局部感染：病原體侵入機(jī)體后 局限就在一定部位生長(zhǎng)繁殖引起病變的一種感染類型 毒血癥：致病菌侵入宿主體后 只在機(jī)體局部生長(zhǎng)繁殖 病菌不進(jìn)入血液循環(huán) 但其產(chǎn)生的外毒素入血 引起特殊的毒性癥狀

　　敗血癥：致病菌侵入血流后 在其中大量繁殖并產(chǎn)生毒性產(chǎn)物 引起全身性毒性癥狀

　　內(nèi)毒素血癥：革蘭陰性菌侵入血流 并在其中大量繁殖 崩解后釋放出大量毒素 也可有病灶內(nèi)大量革蘭陰性菌死亡 釋放的內(nèi)毒素入血所致

　　培養(yǎng)基：是指人工方法配制的適合細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)

　　CFU：菌落形成單位

　　細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）：是指某些病毒感染組織細(xì)胞后 正常生長(zhǎng)的梭形細(xì)胞變圓 變性 壞死 溶解及從培養(yǎng)瓶壁脫落 細(xì)胞堆積形成葡萄狀

　　包涵體：某些病毒感染細(xì)胞后 可在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中形成包涵體

　　醫(yī)院感染：是指住院患者在醫(yī)院內(nèi)獲得的感染 包括在住院期間發(fā)生的感染和在醫(yī)院內(nèi)獲得出院后發(fā)生的感染 但不包括在入院前已開始或住院時(shí)已存在的感染

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