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公衛(wèi)執(zhí)業(yè)醫(yī)師考點:包蟲病診斷標(biāo)準(zhǔn)附錄C

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公衛(wèi)執(zhí)業(yè)醫(yī)師考點:包蟲病診斷標(biāo)準(zhǔn)附錄C

  人體包蟲病免疫學(xué)診斷方法有間接紅細胞凝集試驗(IHA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、PVC薄膜快速ELISA等。其中,以ELISA法最為常用且較敏感。現(xiàn)有的包蟲病免疫學(xué)試驗方法在敏感性和特異性上存在很大的差異。試驗結(jié)果受許多因素的影響:抗原的性質(zhì)和質(zhì)量;檢測用的試驗系統(tǒng);棘球囊的數(shù)量、部位和活力;不同地理蟲株差異;個體免疫應(yīng)答反應(yīng)的差異等。約10%~40%的手術(shù)確診的包蟲病患者用目前已知的抗原檢測不到特異性抗體。本規(guī)范中列出了國內(nèi)外普遍應(yīng)用的一些方法。

  C.1 抗原制備

  C.1.1囊液粗抗原:完整的棘球組織表面清洗干凈消毒后,無菌抽取囊液(宜使用無化膿和無鈣化的可育囊)。將囊液經(jīng)5000 r/min離心20 min,上清液凍存?zhèn)溆谩?/p>

  C.1.2 純化抗原

  可用磷鎢酸、氯化鎂沉淀法對棘球囊液抗原進行部分純化。取20ml離心后的囊液上清,加入2mol/L MgCl2和4%磷鎢酸(用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5~7.6)各1.2ml;室溫攪拌5 min,5000r/min 離心30 min;將沉淀用0.02mol/LpH7.2 PBS溶解;4oC 透析24小時,測定蛋白濃度,~20 oC凍存。

  C.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)

  C.2.1 抗原

  囊液粗抗原、純化抗原、特異性抗原。

  C.2.2 操作方法

  C.2.2.1 抗原包被:用0.05 mol/L pH9.6碳酸緩沖液稀釋抗原至工作濃度,每孔加入100 μl,置溫盒4℃過夜。次日,傾去抗原,用含0.05%吐溫~20的磷酸鹽緩沖液(0.02mol/L .pH7.4 PBST)洗滌3次,每次3 min,拍干;

  C.2.22 加待檢血清:血清用含3%BSA的PBST 1∶200稀釋,每孔加入100 μl,每板應(yīng)設(shè)參考陽性一孔,參考陰性三孔及PBS對照一孔。置溫盒,37℃ 1 h,取出傾去血清,同前洗滌3次;

  C.2.2.3加酶標(biāo)記第二抗體:加入工作濃度的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗人IgG 100 μl,37℃,1 h,傾去第二抗體,同前洗滌;

  C.2.2.4 加底物顯色:加鄰苯二胺(OPD,橙紅色)或四甲基胺/四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMB/TMBS,藍色)底物溶液100 μl,37℃,30 min;

  C.2.2.5 加終止液:2 mol/L . H2SO4 50 μl.

  C.2.3 結(jié)果判斷

  在酶標(biāo)儀上讀取492 nm(OPD)或450 nm(TMB/TMBS)吸光值,以待測樣本(S)對陰性對照血清(N)的S/N≥2.1為陽性臨界值。

  C.3 間接紅細胞凝集試驗(IHA)

  C.3.1 紅細胞醛化

  C.3.1.1 從綿羊頸靜脈無菌采血100ml,加入200ml~400ml阿氏液(400ml三蒸水中溶解葡萄糖8.2g、NaCI 1.68g、檸酸三鈉2.4g和檸酸0.22g,調(diào)pH至6.1,高壓或過濾除菌)中,混勻抗凝。3000 r/min離心15 min,棄上清;

  C.3.12 用生理鹽水洗滌紅細胞3次,同上離心。沉淀中加入50ml生理鹽水和100ml PBS(0.15 mol/L ,pH8.0)混勻;

  C.3.13 加入經(jīng)10% Na2CO3中和的戊二醛300ml(10% Na2CO3 75ml與25%戊二醛225ml混合)于磁力攪拌器4℃緩慢攪拌24 h;

  C.3.14+ 離心棄上清,沉淀用生理鹽水洗滌5次。最后,將紅細胞沉淀用含0.1% NaN3的生理鹽水配成10%細胞懸液,4℃保存。

  C.3.2 紅細胞致敏

  C.3.2 1.將10%戊二醛醛化的綿羊紅細胞20ml 用生理鹽水300ml 洗3次(3000 r/min,5 min),紅細胞壓積約為2ml;

  C.3.2 .2加入生理鹽水98ml,將紅細胞配成2%懸液100ml;

  C.3.2. 3與1:10000酸100ml混合于37 oC水浴30 min,每10 min混旋一次;

  C.3.2. 4同步驟1離心洗3次,棄上清;

  C.3.2. 5沉淀加入生理鹽水198ml,將化紅細胞配成1%懸液200ml;

  C.3.2. 6.與稀釋好的囊液抗原200ml 混合,37 ℃水浴30 min,每10 min混旋一次;

  C.3.2. 7離心棄上清,用1%兔血清PBS(0.15 mol/L pH7.2 PBS)洗3次,棄上清;

  C.3.2. 8 用10%兔血清PBS 18ml將紅細胞配成10%致敏紅細胞20ml.置4℃冰箱保存。

  C.3.3 操作方法

  C.3.3.1 準(zhǔn)備抗原:用0.15 mol/L pH7.2 PBS將10%致敏紅細胞保存液稀釋至1%備用;

  C.3.3.2血凝板每孔加入25 μl PBS;

  C.3.3.3第一孔加入待檢血清25 μl,用移液器或稀釋棒從第一孔開始逐孔向后稀釋;

  C.3.3.4每孔加1%致敏紅細胞25 μl,振蕩混合3 min,置37℃反應(yīng)1h,判定結(jié)果;

  C.3.3. 5.對照設(shè)置:每批試驗均應(yīng)設(shè)置陽性、陰性和紅細胞對照(紅細胞對照孔只有PBS和致敏紅細胞)。

  C.3.4 結(jié)果判斷

  C.3.41 陰性反應(yīng):紅細胞全部沉入孔底呈點狀,邊緣光滑;

  C.3.42陽性反應(yīng):++++ 100%紅細胞凝集;+++ 75%紅細胞凝集;++ 50%紅細胞凝集;+ 25%紅細胞凝集。

  以血清1∶128稀釋出現(xiàn)陽性反應(yīng)者(++)判為血清抗體陽性。

  C.4 PVC薄膜快速ELISA

  C.4.1 抗原

  囊液粗抗原、純化抗原、特異性抗原

  C.4.2 操作方法

  C.4.2.1 取已包被好抗原的PVC薄膜軟板,編號,用PBST洗1次,然后每孔加PBST 200 μl;

  C.4.2.2 加待檢血清及參考血清(每板作陰性對照一孔、陽性對照一孔)每孔10 μl,混勻,置濕盒37℃ 5 min(或25℃室溫10 min)。傾去血清,用PBST連續(xù)洗8次,甩干;

  C.4.2.3加酶標(biāo)抗體:每孔加工作濃度酶標(biāo)抗體 200 μl,37℃ 5 min,同上洗滌8次,再加蒸餾水洗一次,甩干;

  C.4.2.4 加底物顯色:每孔加TMB底物200 μl,反應(yīng)5 min~10 min(TMB底物溶液的制備:TMB 50 mg溶于10ml二甲基亞砜中作為母液,4℃保存。用前取母液1ml+pH 5.0檸酸緩沖液50ml+30% H2O2 8 μl)。

  C.4.3 結(jié)果判斷

  參照陰性及陽性對照,用目視法判斷結(jié)果。陰性基本無色,陽性為鮮藍色。

  C.5 免疫印跡技術(shù)(Western blot,WB)

  C.5.1 抗原膜制備

  囊液粗抗原、原頭節(jié)粗抗原或特異性純化抗原進行常規(guī)SDS-PAGE凝膠電泳,分離膠濃度為15%,抗原蛋白經(jīng)SDS~PAGE電泳分離后,再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。經(jīng)Ponceau S染色,標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)分子量位置。將抗原膜用封閉液(3%脫脂奶粉,0.15 mol/L NaCl,0.05 mol/L Tris-HCl,pH 7.4,0.02%吐溫~20)封閉1 h后將膜裁成寬2-3 mm的膜條備用。此抗原膜條,可夾在PBS濕濾紙中封于塑料袋內(nèi),4℃保存?zhèn)溆。若置低溫冰箱中,可長期保存。

  C.5. 2 操作方法

  C.5.2.1 將抗原膜置于反應(yīng)槽中,加入用封閉液(3 %脫脂奶粉,0.15 mol/L NaCl,0.05 mol/L Tris-HCl,pH 7.4,0.02%吐溫~20)1:100稀釋的待檢血清,每批試驗應(yīng)設(shè)參考陽性、陰性和PBS對照。室溫振搖2 h(4℃可過夜)。次日,用上述封閉液洗4次,每次5 min;

  C.5.2.2加入工作濃度的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗人IgG,室溫2 h,同前洗滌;

  C.5.2.3加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB,棕色)顯色至清晰后,蒸餾水終止反應(yīng),將反應(yīng)膜干燥保存。

  C.5.3 判讀結(jié)果

  細粒棘球特異性反應(yīng)條帶:8 kDa、16 kDa、20-24 kDa(AgB)和38 kDa(Ag5)

  多房棘球特異性反應(yīng)條帶:18 kDa(Em18)、54 kDa(Em2)和220 kDa(EmAP)

  C.6 循環(huán)抗原檢測(circulating antigen,cAg)

  C.6.1 特異性單克隆或多克隆抗體的制備

  C.6.1.1用粗抗原或特異性抗原免疫Balb/c小鼠,按常規(guī)方法進行細胞融合、陽性細胞克隆篩選和鑒定,將分泌特異性單克隆抗體的細胞株腹腔注射小鼠,獲得單克隆抗體腹水;

  C.6.1.2 用粗抗原或特異性抗原免疫兔,獲得高效價的多克隆抗體;

  C.6.1.3建立可檢測粗抗原或特異性抗原的敏感的雙抗體夾心ELISA方法;

  C.6.1.4用建立的雙抗體夾心ELISA反應(yīng)系統(tǒng)檢測病人血清中的cAg.

  C.6.2 循環(huán)抗原檢測

  C.6.2.1 將特異性單克隆抗體或多克隆抗體用0.05 mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋至工作濃度包被酶標(biāo)板,每孔100 μl,4℃過夜后用PBST洗板3次;

  C.6.2.2每孔加入含3%BSA的PBST 100 μl,于37℃封閉1 h,洗板3次;

  C.6.2.3 待檢血清用上液1∶2稀釋,每孔加100 μl,37℃溫育1h,洗板3次;

  C.6.2.4 加工作濃度的酶標(biāo)記第二抗體(特異性單抗或多抗)100 μl 37℃ 1h后,洗板3次;

  C.6.2.5 加鄰苯二胺(OPD,橙紅色)或四甲基胺/四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMB/TMBS,藍色)底物溶液100 μl,37℃,30 min;

  C.6.2.6 加入50 μl 2 mol/L H2SO4,終止反應(yīng);

  C.6.2.7 酶標(biāo)儀測各孔吸光值;

  C.6.2.8 對照設(shè)置和結(jié)果判定:每板設(shè)陽性對照一孔(1 μg/ml抗原100 μl),陰性血清對照三孔,以陰性對照OD均值+3SD或S/N≥2.0為陽性臨界值。

  C.7 循環(huán)免疫復(fù)合物檢測(circulating immune complex,CIC)

  C.7.1 檢測CIC中的循環(huán)抗原

  C.7.1.1. 用0.01 mol/L pH8.4硼酸鹽緩沖液將PEG6000配成7%溶液,取此液100 μl加等量1∶2待檢血清混合置室溫下1h后,5000 r/min離心1 h;

  C.7.1.2 吸去上清液,在沉淀中加含有8 mol/L 尿素的0.05mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液0.5ml,溶解沉淀物;

  C.7.1.3. 用此液包被酶標(biāo)板每孔100 μl,每份標(biāo)本包被兩孔,4℃過夜后,洗板3次(陽性及陰性對照同樣處理);

  C.7.1.4. 每孔加含有2%BSA的PBST 100 μl,37℃封閉1 h,洗板3次;

  C.7.1.5. 加入HRP標(biāo)記的工作濃度特異性單抗或多抗100 μl,37℃下1h后洗板3次;

  C.7.1.6 加鄰苯二胺(OPD,橙紅色)或四甲基胺/四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMB/TMBS,藍色)底物溶液100 μl,37℃,30 min.

  C.7.1.7. 加入2 mol/L H2SO4 50 μl終止反應(yīng);

  C.7.1.8 酶標(biāo)儀測各孔吸光值;

  C.7.1.9 對照設(shè)置和結(jié)果判定:每板設(shè)陽性對照一孔(1 μg/ml抗原100 μl),陰性血清對照三孔,以陰性對照OD均值十3 SD為陽性臨界值。

  C.7.2 檢測CIC

  C.7.2. 1 特異性抗體的制備同C.6.1;

  C.7.2.2 將特異性單克隆抗體或多克隆抗體用0.05 mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋至工作濃度包被酶標(biāo)板,每孔100 μl,4℃過夜后用PBST洗板3次;

  C.7.2.3 每孔加入含3%BSA的PBST 100 μl,于37℃封閉1 h,洗板3次;

  C.7.2.4 待檢血清用上液1∶20稀釋,每孔加100 μl,37℃溫育1h,洗板3次;

  C.7.2.5 加工作濃度的酶標(biāo)記抗人IgG或IgM 100 μl 37℃ 1h后,洗板3次;

  C.7.2.6加鄰苯二胺(OPD,橙紅色)或四甲基胺/四甲基聯(lián)苯胺硫酸鹽(TMB/TMBS,藍色)底物溶液100 μl,37℃,30 min.

  C.7.2.7加入2mol/L H2SO4 50 μl終止反應(yīng);

  C.7.2.8酶標(biāo)儀測各孔吸光值;

  C.7.2.9對照設(shè)置和結(jié)果判定:每板設(shè)陽性對照一孔(人工復(fù)合物),陰性血清對照三孔,以陰性對照OD均值+3SD或S/N ≥2.0為陽性臨界值。

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