大專醫(yī)學(xué)的畢業(yè)論文
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紅芪多糖的純化及初步結(jié)構(gòu)鑒定
論文摘要：目的研究紅芪多糖的分離純化及初步的結(jié)構(gòu)。方法采用超聲輔助提取多糖，比較 Sevag法、三氯乙酸法和三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白的效果，并用 GC、TLC及 IR分析多糖的初步結(jié)構(gòu)。結(jié)果三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白，經(jīng) Sephadex G-25柱層析分離純化后得紅芪多糖2(HPS-2)，HPLC確定為均一多糖，糖含量為 98.2%，糖組成分析表明其含有鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖，摩爾比為 .3∶.2∶2.7∶16.1∶2.。結(jié)論HPS-2是一種以 β苷鍵為主的吡喃型雜多糖。
關(guān)鍵詞：紅芪多糖; 薄層色譜; 結(jié)構(gòu)鑒定
紅芪(Radix Hedysari)，為豆科巖黃芪屬植物多序巖黃芪Hedysarumpolybotrys Hand.-Mazz的干燥根，為甘肅特產(chǎn)名貴藥材，在臨床上主要用于補(bǔ)氣固表， 利尿托毒， 排膿， 斂瘡生肌。紅芪中含有氨基酸、有機(jī)酸、β-谷甾醇、紅芪多糖、微量元素等眾多的生物活性物質(zhì)[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，紅芪多糖的`活性成分具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗衰老、治療糖尿病等作用[1，2]。特別是我們近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng) 7%乙醇沉淀部分藥理作用尤為明顯。由于多糖為大分子化合物，分離純化比較困難，而蛋白質(zhì)的脫除是后期結(jié)構(gòu)鑒定的關(guān)鍵之一，為了提高多糖的得率、純度及活性，本實(shí)驗(yàn)對(duì)這部分多糖進(jìn)行了脫蛋白方法的研究，結(jié)合TLC、GC、IR等方法對(duì) HPS-2 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步的分析，以期為紅芪多糖的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。
1 材料與儀器
紅芪，購(gòu)自甘肅武都;牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán) G-25(西安周鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司);單糖對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);Sephadex G-25(上海長(zhǎng)征制藥廠);硅膠 G(青島海洋化工廠);其它試劑均為分析純。
CR22G Ⅱ型離心機(jī)(日本日立);UV-17 型紫外儀(日本島津);GC-Clarus 5型氣相色譜儀(美國(guó) PerkinElmer公司);紅外光譜儀(Nicolet NEXUS 67);BS-1A 自動(dòng)部分收集器、HL-2 恒流泵(上海滬西分析儀器廠有限公司);美國(guó)Waters6型高效液相色譜儀，配 Waters2414型示差折光檢測(cè)器。
2 方法
2.1 紅芪多糖的提取純化路線其流程如下。
2.1.1 提取紅芪藥材→粉碎→超聲脫脂→熱水提取3次→合并提取液→減壓濃縮后離心→取上清液→乙醇沉淀→有機(jī)溶劑洗劑→透析→減壓濃縮→冷凍干燥得粗多糖 HPS。
2.1.2 純化粗多糖液→脫蛋白、色素→Sephadex G-25柱層析→洗脫液透析→濃縮→冷凍干燥→精制紅芪多糖 HPS-2。
2.2 蛋白質(zhì)和多糖含量的測(cè)定蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬氏亮藍(lán)法[3]，多糖含量采用苯酚-硫酸法[4]。
2.3 脫蛋白方法
稱取一定量的粗多糖，加入適量蒸餾水，6℃加熱溶解，備用。本實(shí)驗(yàn)采用 3種脫蛋白的方法。
2.3.1 Sevag法取粗多糖溶液，加入等體積的氯仿-正丁醇(V/V為 4∶1)試劑，混合振搖 3 min，離心除去沉淀，透析后醇沉，冷凍干燥，即得脫蛋白多糖。
2.3.2 三氯乙酸法取粗多糖溶液，加入多糖溶液體積 .1倍量的三氯乙酸，低溫(4℃)劇烈振搖 3 min，離心除去沉淀，透析后醇沉，冷凍干燥，即得脫蛋白多糖。
2.3.3 三氯乙酸-正丁醇法
取粗多糖溶液，加入等體積的三氯乙酸-正丁醇(V/V為 1∶1)試劑，振蕩 1 min，靜置分層，收集下層水溶液，透析后醇沉，冷凍干燥，即得脫蛋白多糖。
2.4 紅芪多糖的精制將一定量的脫蛋白多糖，溶解于適量蒸餾水中。過氧化氫除色素，減壓濃縮，經(jīng)醇沉、離心、冷凍干燥得紅芪多糖1(HPS-1)，取適量的 HPS-1，蒸餾水溶解后，Sephadex G-25柱分離，蒸餾水洗脫，流速 .8 ml/min，每 3 ml收集1份，苯酚-硫酸法跟蹤檢測(cè)，繪制洗脫曲線，合并主峰流出液，減壓濃縮至一定體積，冷凍干燥得 HPS-2。
2.5 純度鑒定用 HPLC法，TSK-gel G25PW色譜柱，示差折光檢測(cè)器，流動(dòng)相為雙蒸水，流速 1. ml/min，檢測(cè)器溫度35℃，樣品濃度4 mg/ml，進(jìn)樣量5 μl。同時(shí)取該樣品溶液在 2～4 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描。
2.6 氣相色譜參照文獻(xiàn)[5]，多糖樣品經(jīng)徹底水解后制備糖腈乙酸酯衍生物，以單糖的糖腈乙酸酯衍生物為對(duì)照品進(jìn)行 GC分析。色譜條件: OV-11毛細(xì)管柱(5 m×. 32 mm)，載氣為N2 ，流速 5 ml/min，分流比 4∶1，F(xiàn)ID氫火焰檢測(cè)器，汽化室溫度 25℃，檢測(cè)器溫度 28℃。程序升溫:11℃(保持 5 min)→(5℃/min)→ 28 ℃(保持 2 min)。進(jìn)樣量 .4 μl。
2.7 薄層色譜[6]取 15mg HPS-2，三氟醋酸徹底水解，水解產(chǎn)物溶于 1 ml蒸餾水中，以標(biāo)準(zhǔn)單糖為對(duì)照，分別取樣品水解液和單糖對(duì)照液在含磷酸二氫鈉的硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，上行二次展開，展開劑: 醋酸乙酯∶冰醋酸∶甲醇∶水=12∶3∶3∶2(V/V);自然風(fēng)干后顯色，顯色劑: 苯胺-鄰苯二甲酸溶液，烘箱中 15 ℃加熱 5～1 min顯色。
2.8 紅外光譜測(cè)定 取 2 mg HPS-3，KBr壓片，測(cè)定紅外光譜。
3 結(jié)果
3.1 脫蛋白方法的選擇以蛋白脫除率和多糖損失率為指標(biāo)，比較 Sevag法、三氯乙酸法和三氯乙酸-正丁醇法的脫蛋白效果(見圖1)。Sevag法的多糖損失率最低，但脫蛋白率也最低;三氯乙酸-正丁醇法的脫蛋白率最高，多糖損失率最低;三氯乙酸法的脫蛋白率達(dá) 3%以上，但多糖損失最高。綜合各方面的因素，本實(shí)驗(yàn)選取三氯乙酸-正丁醇法脫除紅芪多糖中的蛋白質(zhì)。
3.2 紅芪多糖分離純化紅芪多糖經(jīng)Sephadex G-25柱層析純化分離的洗脫曲線(見圖2)。僅出現(xiàn) 1個(gè)洗脫峰， 收集主峰， 透析， 濃縮，冷凍干燥， 得到 HPS-2。
3.3 純度鑒定HPS-2的紫外掃描在 26～28nm處吸收峰消失，茚三酮反應(yīng)呈陰性，說明樣品中的蛋白質(zhì)基本除盡，也無核酸存在;碘-碘化鉀反應(yīng)呈陰性，表明樣品為非淀粉多糖;經(jīng) HPLC凝膠色譜后為單一對(duì)稱峰。表明其為均一組分;苯酚-硫酸法測(cè)定 HPS-2的糖含量為 98.6%。
3.4 紅芪多糖的結(jié)構(gòu)分析
3.4.1 氣相色譜分析
氣相色譜分析(見圖 3)。比較標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的保留時(shí)間，可見多糖 HPS- 2由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖5種單糖組成。其摩爾組成比例為 .3∶.2∶2.7∶16.1∶2.。
3.4.2 薄層色譜分析HPS-2 經(jīng)薄層色譜(見圖 4)。檢出半乳糖(Rf對(duì)=Rf樣=.4)、葡萄糖(Rf對(duì)=Rf樣=.3)、阿拉伯糖(Rf對(duì)=.2，Rf樣=.19)、木糖(Rf對(duì)=Rf樣=.62)和鼠李糖(Rf對(duì)=Rf樣=.77)，其中木糖和鼠李糖含量較低，斑點(diǎn)不明顯。這與氣相色譜結(jié)果一致。
3.4.3 紅外分析從IR譜圖由圖 5可見，HPS-2在 3 6～3 2 cm-1、3 ～2 8 cm-1和 1 4～1 2 cm-1處均具有多糖的特征吸收峰。1 154、1 8、1 24 cm-1處為 β-吡喃糖基的振動(dòng)峰[7];898 cm-1為 β-糖苷鍵的吸收峰，82 cm-1處為 α-吡喃糖的吸收峰，說明多糖 HPS-2中存在 α和 β兩種類型的苷鍵，并以吡喃型糖為主。
4 結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)比較了3種脫蛋白方法，三氯乙酸-正丁醇法脫蛋白效果最好，脫除率達(dá) 37.2%，多糖損失率少。利用葡聚糖凝膠 Sephadex G-25柱層析分離純化紅芪多糖得 HPS-2，經(jīng) HPLC及紫外掃描為均一多糖，不含蛋白質(zhì)和核酸。
GC、TLC及 IR分析 HPS-2的糖基組成和結(jié)構(gòu)為，主要由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖5種單糖組成，其摩爾比為 .3∶.2∶2.7∶16.1∶2.，單糖主要為吡喃糖，異頭碳以 β型為主，并有少量的 α型。這為紅芪多糖的深入研究打下了理論基礎(chǔ)，特別為其組成的快速分析提供了可靠的方法。
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