當(dāng)歸炭飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究
本文選取甘肅道地產(chǎn)區(qū)的當(dāng)歸，按照《甘肅省中藥炮制規(guī)范》規(guī)定的方法炮制，采用傳統(tǒng)鑒別和色譜指紋圖譜結(jié)合的方法來控制當(dāng)歸炭飲片的質(zhì)量，為當(dāng)歸炭飲片質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。
【摘要】
目的建立當(dāng)歸炭飲片質(zhì)量控制方法，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。方法觀察當(dāng)歸炭飲片性狀;對(duì)其粉末進(jìn)行顯微鑒別;根據(jù)《中國藥典》規(guī)定的方法測(cè)定水分、灰分、酸不溶性灰分及其浸出物;采用薄層色譜法對(duì)其進(jìn)行鑒別;基于當(dāng)歸炭飲片HPLC圖譜，以阿魏酸峰為基準(zhǔn)峰，計(jì)算阿魏酸的含量，對(duì)樣品中指認(rèn)的指紋峰以阿魏酸為參照，計(jì)算每個(gè)指紋峰以阿魏酸計(jì)的含量。結(jié)果當(dāng)歸炭和生當(dāng)歸相比，外觀性狀、顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生了較明顯的變化，組織顏色加深，淀粉粒被糊化，油細(xì)胞被破壞。水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物測(cè)量平均值分別為3.3%，11.5%，4.1%和49.2%，確定了1個(gè)指紋峰，計(jì)算出指紋峰以阿魏酸計(jì)的含量。結(jié)論建立了當(dāng)歸炭飲片多指標(biāo)成分的定量方法，方法具有可操作性，使藥品質(zhì)量控制更全面。
【關(guān)鍵詞】
當(dāng)歸炭飲片; 質(zhì)量控制; 定量方法; 阿魏酸
Abstract：ObjectiveTo establish the quality standard of carred Radix. Angelica Sinensis. MethodsTraditional identification， TLC and fingerprints of Carred Radix Angelica Sinensis were adopted to control quality of carred Radix Angelica Sinensis. The ten common peak were appointed as fingerprint peaks， all the fingerprint peaks were quantified grounded on the peak of Ferulic acid. Referring to China Pharmacopoeia (25)， water， ash， and extract were also detected.
ResultsAppearance， microscopic structure of Radix Angelica Sinensis changed obviously， color of tissue deepened， starch granule gelatinized， oil cells were destroyed. The content of water， total ash， acid-insoluble ash and extract were 3.3%，11.5%，4.1%and 49.2%， respectively. Ten fingerprint peaks were defined， and quantified rested on the peak of ferulic acid. ConclusionA multicomponent quantitative method for the carred Radix Angelica Sinensis was established. The established method is feasible. The quality control standards of the carred Radix Angelica sinensis is normative， systematic and accurate.
Key words： Carred Radix Angelica Sinensis; Quality standards; Quantitative method; Ferulic acid
當(dāng)歸為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸Angelica sinesis(Oliv.)Diels的干燥根[1]，主產(chǎn)于甘肅岷縣，屬甘肅地道藥材，主要成分含揮發(fā)油和水溶性物質(zhì)兩大類。揮發(fā)油中以藁本內(nèi)酯和正丁烯酉夫內(nèi)酯為主要成分;水溶性物質(zhì)以阿魏酸和丁二酸為主要成分[2]，是中(獸)醫(yī)臨床常用藥，性溫，味甘、辛，具有補(bǔ)血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤燥滑腸等功效。當(dāng)歸炭入藥，最初見于明代方賢《奇效良方》成為“火化法”，之后清代又有“煅法”“燒法”的記錄，如“燒末為灰”，但均需存性，當(dāng)歸炭至今仍為中醫(yī)臨床所選用[3]，由于當(dāng)歸本有活血作用，炒炭后又善止血，所以當(dāng)歸炭尤宜于瘀阻出血證。當(dāng)歸炭質(zhì)量優(yōu)劣直接關(guān)系到中醫(yī)及中獸醫(yī)臨床的療效，而目前還沒有一個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量控制的方法。因此，本文選取甘肅道地產(chǎn)區(qū)的當(dāng)歸，按照《甘肅省中藥炮制規(guī)范》規(guī)定的方法炮制，采用傳統(tǒng)鑒別和色譜指紋圖譜結(jié)合的方法來控制當(dāng)歸炭飲片的質(zhì)量，為當(dāng)歸炭飲片質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與儀器
1.1 實(shí)驗(yàn)儀器顯微鏡，自動(dòng)薄層制板器，KQ-36DE型數(shù)控超聲波清洗器，玻璃儀器烘干器，TDI5-WS多管架自動(dòng)平衡機(jī)，電子天平，克羅瑪-薄層觀察分析儀(254nm，365nm)，容量瓶，坩堝，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，SX-4-1智能纖維素電阻爐，循環(huán)水式多用真空泵(型號(hào)SHB-111)。
1.2 實(shí)驗(yàn)藥品乙醚、乙醇、石油醚、醋酸乙酯、1%碳酸氫鈉、甲醇、硅膠G薄層、阿魏酸、正己烷、苯、2%碳酸鈉、水合氯醛、稀甘油等所用試劑均為分析純。當(dāng)歸對(duì)照藥材(批號(hào)12927-2613中國藥品生物制品檢定所)，阿魏酸對(duì)照品(批號(hào)773-991中國藥品生物制品檢定所)。
1.3 當(dāng)歸炭取當(dāng)歸片，置鍋內(nèi)，用中火炒至當(dāng)歸外表焦黑色，內(nèi)部棕褐色，略具焦氣，質(zhì)枯脆時(shí)， 取出放涼。并要注意“炒炭存性”[4]。不同產(chǎn)地當(dāng)歸炭樣品分別為t1甘肅漳縣金鐘鎮(zhèn);t2甘肅岷縣中寨鎮(zhèn);t3甘肅九寨鎮(zhèn);t4甘肅岷縣;t5甘肅渭源縣;t6甘肅渭源縣;t7甘肅渭源縣;t8甘肅岷縣;t9甘肅昌縣;t1號(hào)甘肅漳縣;t11甘肅昌縣哈達(dá)鋪;t12甘肅漳縣;t13甘肅岷縣;t14甘肅省岷縣市場(chǎng)購買。
2 方法
2.1 飲片性狀當(dāng)歸炭：當(dāng)歸頭切片有大有小，最大的長為2.6 cm，寬為1.7 cm，厚為.2 cm;最小的長為1.2 cm，寬為1. cm，厚為.1 cm，表面顏色為黑色具縱皺紋，斷面形成層為深褐色具環(huán)紋，木質(zhì)部為棕褐色，還混有粗細(xì)、長短不一的歸身、歸尾其表面均為黑色，根頭部斷面層有裂縫。掰開斷面顏色為黃棕色，質(zhì)脆，香氣較濃味苦、微甜。見圖2。
2.2 飲片鑒別
2.2.1 粉末顯微鑒別當(dāng)歸炭：粉末為焦黑色，可觀察到梯紋、網(wǎng)紋、螺紋導(dǎo)管呈棕褐色，木栓細(xì)胞也呈棕褐色，紡錘形薄壁細(xì)胞有但較少，碎片較多油室基本少見，淀粉粒糊化。見圖3。
2.2.2 薄層色譜鑒別取14個(gè)產(chǎn)地當(dāng)歸炭粉末.5 g，加乙醚1 ml，超聲處理1 min，濾過，取濾液蒸干，殘?jiān)右掖? ml使溶解，作為供試品溶液。另取標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)歸粉末.5 g，依供試品同法操作，即為對(duì)照品溶液;吸取上述15種溶液各5 μl，分別點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上，以石油醚(3～6℃)醋酸乙酯(4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外燈下365 nm波長處觀察熒光斑點(diǎn)。見圖4。
取14個(gè)產(chǎn)地當(dāng)歸炭飲片粉末3 g，加1%碳酸氫鈉5 ml，超聲處理1 min，離心，取上清液，用稀鹽酸調(diào)至pH值2～3，用乙醚振蕩萃取兩次，2 ml/次。合并乙醚液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml，使溶解，作為供試品溶液。吸取上述14種溶液各1 μl，分別點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上;另吸取1 μl阿魏酸點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上作為對(duì)照樣品。以正苯-醋酸乙酯-甲酸(4∶1∶.1)為展開劑，展開，取出，晾干。置紫外燈下365 nm波長處觀察熒光斑點(diǎn)。見圖5。
2.3 檢查照《中國藥典》25 年版Ⅰ部(附錄)，分別測(cè)定當(dāng)歸樣品中的水分，總灰分，酸不溶性灰分，浸出物測(cè)定法項(xiàng)下醇溶性浸出物測(cè)定法熱浸法測(cè)定。結(jié)果見表1。表1 14個(gè)產(chǎn)地當(dāng)歸樣品中水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物測(cè)定結(jié)果(略)
2.4 基于當(dāng)歸炭飲片的HPLC圖譜的樣品含量測(cè)定
2.4.1 色譜條件Agilent Zorbax SB2C18 (4.6 mm×25cm，5μm)分析柱;流動(dòng)相:1%乙酸水(A相)：乙腈(B相);梯度洗脫條件:B，～1 min (8% ～13%);18～2min(13%～18%);2～28min(18%～2%);28～5 min (2%～49% );5～55 min (49% );55～75 min(49% ～1%)。流速:1 ml·min-1;柱溫:25 ℃;檢測(cè)波長:28 nm。
2.4.2 阿魏酸對(duì)照品溶液制備稱取阿魏酸對(duì)照品4.8 mg，加甲醇至1 ml容量瓶中，得4.8 μg·ml-1對(duì)照品溶液。
2.4.3 供試品溶液制備精密稱取當(dāng)歸粉末(4目).5 g，置5 ml具塞三角瓶中，精密量取甲醇-甲酸(95∶5)溶液25 ml加入三角瓶中，密封，稱重，超聲提取6 min，放置至室溫，稱重，補(bǔ)足失重， .45 μm濾膜過濾。取續(xù)濾液進(jìn)樣1 μl。
2.4.4 指紋峰的鑒定采用相對(duì)保留時(shí)間確認(rèn)峰。指紋峰峰面積比值即各指紋峰面積與同一圖譜中阿魏酸峰面積的比值。
3 結(jié)果
3.1 方法學(xué)考察精密度 取同一份當(dāng)歸樣品(t4)的供試液，重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算得各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為.3%～.14% ， 峰面積比值RSD為.54%～2.6% ，符合指紋圖譜的檢測(cè)要求。
3.1.1 穩(wěn)定性取同一份當(dāng)歸樣品(t4)的供試液，分別于，3，6，9，12和15 h檢測(cè)，計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為.3%～.12%，峰面積比值RSD為.29%～2.66% ，表明供試液在15 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
3.1.2 重復(fù)性取當(dāng)歸樣品(t4) 6份，分別精密稱定，按供試品溶液制備方法平行制備供試液，再分別按上述液相色譜條件測(cè)定， 計(jì)算各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為.28% ～.46%，峰面積比值RSD為.75% ～1.82% ，符合指紋圖譜的檢測(cè)要求。
3.1.3 當(dāng)歸樣品中指紋峰的定量按上述液相色譜條件測(cè)定了自14個(gè)不同產(chǎn)地的當(dāng)歸炭樣品，根據(jù)各樣品圖譜中色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和阿魏酸對(duì)照品的相對(duì)保留時(shí)間，鑒定1個(gè)指紋峰，見圖6。峰1為阿魏酸，將指紋峰的紫外光譜與文獻(xiàn)[5～8]比較，推測(cè)峰2～1依次為洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、丁基酜內(nèi)酯、E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯、Z-丁烯基酞內(nèi)酯、levistolide A.。對(duì)這些指紋峰含量以基準(zhǔn)峰阿魏酸為依據(jù)，計(jì)算每個(gè)指紋峰的相對(duì)含量。結(jié)果見表2。表2 14批當(dāng)歸炭樣品指紋峰以阿魏酸計(jì)相對(duì)含量測(cè)定結(jié)果(略)
4 討論
“道地藥材”是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)藥材，可以用某中藥的道地藥材的質(zhì)量情況作為該中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究選擇甘肅道地產(chǎn)區(qū)的當(dāng)歸樣品，對(duì)當(dāng)歸炭(14批)各組研究數(shù)據(jù)資料進(jìn)行系統(tǒng)分析，以此為基礎(chǔ)制定當(dāng)歸炭飲片的名稱、藥材來源、飲片規(guī)格、顯微鑒別、水分限量、總灰分限量、酸不溶性灰分限量、浸出物限量及以阿魏酸為基準(zhǔn)的有效成分相對(duì)含量下限等質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸炭的顯微結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化，組織顏色加深、油細(xì)胞減少、淀粉�；径急缓�，而其外部變化也非常明顯，如表面呈焦黑色等，水分含量明顯下降，而灰分含量明顯增加，建議在制定當(dāng)歸炭飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)考慮。
當(dāng)歸炭飲片作為多組分復(fù)雜體系，其化學(xué)成分經(jīng)過炒炭以后發(fā)生了很多變化，如宋金春[9]報(bào)道，制炭后，阿魏酸含量顯著降低，鞣質(zhì)顯著增加，水溶性和醇溶性成分均有下降，加上藥材品種、產(chǎn)地、加工、貯藏等因素的影響，其質(zhì)量控制一直是當(dāng)歸炭飲片分析的重點(diǎn)和難點(diǎn)。目前對(duì)當(dāng)歸炮制品的研究大多停留在飲片的性狀鑒別，25版《中國藥典》上只是規(guī)定了酒當(dāng)歸飲片的性狀，沒有化學(xué)成分的鑒別方法，無法從化學(xué)組分的內(nèi)在因素上鑒定當(dāng)歸炮制品以控制其質(zhì)量，且對(duì)當(dāng)歸藥材只規(guī)定了阿魏酸含量的限度，也不能代表整個(gè)藥材的質(zhì)量[1]，同時(shí)市場(chǎng)上能形成商品的對(duì)照品數(shù)量較少，一味藥多成分定量就成為質(zhì)量分析的難點(diǎn)。本研究針對(duì)以上問題，在分析出的組分中盡可能多地選取含量測(cè)定對(duì)象，選擇一個(gè)能代表某味藥材的組分色譜峰， 然后再選擇其他各味藥材代表峰，并對(duì)代表峰與標(biāo)準(zhǔn)峰比值作一限度范圍，即可對(duì)所要檢測(cè)中藥做出一個(gè)較好的定性定量，以此來控制制劑的質(zhì)量[11]。本文采用以阿魏酸單一對(duì)照品為基準(zhǔn)對(duì)多指標(biāo)成分定量分析方法，測(cè)定洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎內(nèi)酯A、丁基酜內(nèi)酯， E-藁本內(nèi)酯、Z-藁本內(nèi)酯、Z-丁烯基酞內(nèi)酯、levistolide A 1種成分以阿魏酸計(jì)的相對(duì)含量，這樣可以全面控制當(dāng)歸炭飲片的質(zhì)量，提高當(dāng)歸炭飲片質(zhì)量控制水平，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為當(dāng)歸炭飲片的生產(chǎn)、經(jīng)營及鑒定提供了參考標(biāo)準(zhǔn)。
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