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口腔�？飘厴I(yè)論文
1 儀器與材料
紫外分光光度儀：日本島津公司；B-220型恒溫水浴鍋：浙江舟山市定海區(qū)海源儀器廠；KS-150D型超聲波清洗器：寧波科生儀器廠；SHZ-CD 型循環(huán)水式多用真空泵：浙江舟山市定海區(qū)海源儀器廠；WFZ-2000型紫外可見分光光度計：尼龍柯儀器有限公司；Shimadzu LC-l0A型高效液相色譜儀：日本島津公司；BS210S 型電子天平（MAX=210g d=0.01mg）：北京塞多利斯天平有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；XA-1 型固體粉碎機(jī)：金壇市科興儀器廠；SK-1快速混勻器：常州國華電器有限公司。
樣品1： 4月下旬采于淮海工學(xué)院多年生銀杏樹；樣品2： 4月下旬采于花果山九龍橋百年銀杏樹；樣品3： 4月下旬采于連云港花果山三元宮千年銀杏樹；樣品4：頭年10月下旬采于淮海工學(xué)院多年生銀杏樹；樣品5：頭年10月下旬采于連云港花果山九龍橋百年銀杏樹；樣品6：頭年10月下旬采于連云港花果山三元宮千年銀杏樹。6種樣品葉均于55℃恒溫干燥后，粉碎過篩，置于磨口瓶中，密閉避光保存。
槲皮素、山萘酚標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品鑒定所出品）異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品（Biochemika公司），DPPH·（1,1-二苯-2-苦肼基 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ，Sigma 公司），甲醇。甲醇、鹽酸、磷酸、醋酸等均為分析純試劑，水為去離子水（自制）。
2 方法
2.2 樣品溶液制備分別稱取6種樣品0.8 g，置于100 ml圓底燒瓶中，加入25 ml甲醇/25%鹽酸（4∶1）混合液，閉塞稱重，置于水浴中沸騰回流1 h，取出后冷卻至室溫，稱重，以甲醇補(bǔ)足減失重量，過濾后轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶，作為樣品溶液1～6號。
2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液最大吸收波長測定分別將槲皮素、山萘酚和異鼠李素標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液用紫外分光光度儀在200～800 nm進(jìn)行掃描，獲得最大吸收波長并加以選擇，以防止其他成分干擾。
2.4 最佳色譜條件測定通過對流動相中水和甲醇比值、流速及緩沖溶液的選擇等多個方面的改變，獲得將槲皮素、山萘酚和異鼠李素分離的最佳條件。
2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在最佳色譜條件下，分別進(jìn)樣2.5，5，10，15，20，30 μl，以峰面積（mV/min）為縱坐標(biāo)Y，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)X，分別作槲皮素、山萘酚和異鼠李素線性回歸曲線。
2.6 樣品中槲皮素、山萘酚和異鼠李素含量測定和計算取“2.2”制備的樣品液（1～6號）1 ml分別稀釋于10 ml容量瓶中，在最佳色譜條件下，各進(jìn)樣15 μl，測樣品中槲皮素、異鼠李素、山萘酚的峰面積A1，A2，A3，由3者的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程，采用外標(biāo)法，獲得進(jìn)樣黃酮量，按下式算出槲皮素、山萘酚和異鼠李素的含量。
C=（X/15×250）/m樣品
式中：C-樣品中黃酮的含量（mg/g）
X-進(jìn)樣溶液中黃酮的量（μg）
m樣品-樣品的質(zhì)量（g）
2.7 總黃酮苷含量計算銀杏葉中含有30多種黃酮類化合物，主要以糖苷形式存在，直接測定銀杏黃酮苷的含量較困難，因?yàn)榉N類太多分離困難、對照品不易得。而這些苷中的苷元主要是槲皮素、山萘酚和異鼠李素，通過其苷元的含量再換算成總黃酮苷含量。槲皮素（quercetin）的分子量是302.2，山萘酚（kaempferol）和異鼠李素（isorhamnetin）的分子量分別是286.24和316.27。據(jù)報道，槲皮素鼠李糖-對羥基桂皮酰葡萄糖苷（分子量為756.7）是銀杏對心血管系統(tǒng)的主要有效成分，所以被應(yīng)用作為有效成分含量測定時計算的依據(jù)，即黃酮苷與苷元分子量比值取r=756.7/302.2=2.51�？傸S酮苷含量=（Q+K+I）×2.51
Q、K、I分別表示槲皮素、山萘酚和異鼠李素的黃酮含量。
2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)分別精密稱取樣品3粉末3份，在相同的條件下提取溶液，在選定的色譜條件下測定峰面積。
重復(fù)性越好說明實(shí)驗(yàn)的精密度越好，重復(fù)性一般用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示。將被測樣品進(jìn)樣3次，根據(jù)得到峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。
2.9 精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取樣品3稀釋液15 μl，在最佳色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣3次，測得峰面積，計算其標(biāo)準(zhǔn)偏差和RSD值。
2.10 加樣回收率實(shí)驗(yàn)分別準(zhǔn)確移取已知含量的樣品1～3號1 ml于3個10 ml容量瓶中，各加入槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液（288 μg/ml）0.1 ml，混合均勻，按黃酮類化合物的分析方法進(jìn)行檢測，計算槲皮素的回收率。
3 結(jié)果
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高效液相色譜法測定了連云港地區(qū)不同年代春秋兩季的銀杏葉黃酮組分，包括槲皮素、山萘酚和異鼠李素的含量。測得的數(shù)據(jù)表明，6種樣品中春季采摘的銀杏葉中黃酮含量明顯高于秋季銀杏葉。不同樹齡銀杏葉3種黃酮苷元的含量比例順序發(fā)生變化：數(shù)十年銀杏葉樣品中以槲皮素含量居多，百年樣中山萘酚較多，千年樣中異鼠李素含量明顯高于前兩者�？寡趸钚詼y定結(jié)果與其黃酮含量測定結(jié)果基本一致，春季銀杏葉明顯高于秋季銀杏葉。
由表2可知，槲皮素含量在樣品1中最高，為0.459%；其次是樣品4，為0.362%，這兩個樣品采于淮工數(shù)十年生銀杏。千年生銀杏葉與百年生銀杏葉的含量相差不大；山萘酚含量在樣品2中最高，為0.191%，其次是樣品3，為0.134%，說明秋季樣品山萘酚含量隨樹齡呈遞減趨勢；異鼠李素含量在樣品3中最高，為0.240，其次是樣品6，為0.194%。這兩個樣品均采于千年生銀杏，說明異鼠李素含量隨樹齡呈遞增趨勢，春季樣品各黃酮含量均明顯高于同種秋季樣品。
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