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簡(jiǎn)述菊粉酶酶源誘變菌株產(chǎn)酶發(fā)酵條件的優(yōu)化試驗(yàn)
摘要：為提高黑曲霉(Aspergillusniger)A24誘變菌株產(chǎn)菊粉酶的活力，采用單因子試驗(yàn)方法對(duì)該菌株的最佳產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：該菌株在以3%菊芋汁為碳源、2%牛肉膏和0.5%(NH4)2HPO4為復(fù)合氮源的培養(yǎng)基中，初始 pH值6.0，30℃培養(yǎng)72h的條件下，所得的發(fā)酵液中酶活力最高，達(dá)到35.21U/mL，比優(yōu)化前提高了18%，表明該菌株有一定的應(yīng)用潛力。
關(guān)鍵詞：黑曲霉;菊粉酶;酶活力;發(fā)酵條件;優(yōu)化
傳統(tǒng)果糖的生產(chǎn)一般是由淀粉通過(guò)葡萄糖的異構(gòu)化取得，該法工藝復(fù)雜、成本較高、果糖含量低。因此，人們一直在尋求一種廉價(jià)的新糖源和生產(chǎn)果糖的方法。其中菊粉酶(Inulinase或Inulase)主要催化水解菊粉中的β-2，1呋喃果糖苷鍵，由于能在溫和條件下水解菊粉產(chǎn)生果糖(70%以上)和少量葡萄糖，只需一步酶解過(guò)程，工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，可直接制備超高果葡糖漿，已成為果糖工業(yè)化生產(chǎn)的主要酶制劑，為低聚果糖的生產(chǎn)提供了一個(gè)很好的解決辦法。但來(lái)源于植物的菊粉酶底物專(zhuān)一性較強(qiáng)，僅作用于菊粉;由微生物產(chǎn)生的菊粉酶大都能水解含有β-2，1呋喃果糖苷鍵的多種糖類(lèi)，如菊糖、蔗糖和棉子糖等[1]。其中霉菌具有所產(chǎn)菊粉酶的最適溫度較高、熱穩(wěn)定性好、適宜偏酸性的環(huán)境等特點(diǎn)而倍受關(guān)注。由濰坊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室所保存的黑曲霉(Aspergillusniger)A24誘變菌株是從菊芋根際周?chē)寥乐泻Y選出的一株產(chǎn)菊粉酶、又經(jīng)過(guò)多輪紫外線(xiàn)誘變獲得的菊粉酶產(chǎn)量較高的菌株。該試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)一步優(yōu)化，以期獲得更高的產(chǎn)菊粉酶活力，為進(jìn)一步研究菊粉酶的生產(chǎn)以及生產(chǎn)應(yīng)用提供理論基矗
1、材料與方法
1.1供試材料
黑曲霉(Aspergillusniger)A24誘變菌株，由濰坊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。菊芋(HelianthustuberosusL.)采自濰坊市郊區(qū)。菊芋汁參照前人研究方法進(jìn)行制備[2]。
1.2發(fā)酵培養(yǎng)條件及發(fā)酵液的制備
取0.1mL黑曲霉孢子懸液，接入50mL的YJ(初始培養(yǎng)條件：菊粉2%，酵母膏0.3%，(NH4)2HPO41%，初始pH值6.0)發(fā)酵培養(yǎng)液中(250mL三角瓶)，在不同條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
1.2.1不同碳源對(duì)產(chǎn)菊粉酶的影響。選擇碳源分別為2%的菊芋汁、菊粉、葡萄糖、果糖、庶糖和乳糖，將黑曲霉A24誘變菌種接入到不同碳源的培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)各培養(yǎng)基初始pH值為6.0，在30℃、120r/min的條件下培養(yǎng)72h，將各處理的發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心10min后，收集上清液，分別測(cè)定酶活力。并選擇出最優(yōu)碳源，以1%、2%、3%、4%的添加量研究不同濃度的該最優(yōu)碳源對(duì)產(chǎn)菊粉酶的活力影響。
1.2.2不同氮源對(duì)產(chǎn)菊粉酶的影響。用3%的菊芋汁作碳源，以不同種類(lèi)的復(fù)合氮源(有機(jī)和無(wú)機(jī))制備的培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)3d后，測(cè)定其發(fā)酵液中菊粉酶活力，確定最佳有機(jī)氮源;在確定最佳有機(jī)氮源為牛肉膏、無(wú)機(jī)氮源為(NH4)2HPO4的基礎(chǔ)上，進(jìn)行有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源最佳配比試驗(yàn)。以牛肉膏和(NH4)2HPO4做復(fù)合氮源發(fā)酵試驗(yàn)，取質(zhì)量濃度分別為1%、2%、3%的牛肉膏和質(zhì)量濃度分別為0.3%、0.5%、0.8%的(NH4)2HPO4進(jìn)行復(fù)合。調(diào)培養(yǎng)基初始pH值為6.0，于30℃，發(fā)酵培養(yǎng)3d，將各處理的發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心10min后，收集上清液，分別測(cè)定酶活力。
1.2.3培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)菊粉酶的影響。設(shè)培養(yǎng)基初始pH值分別為3、4、5、6、7，以3%菊芋汁作碳源，以牛肉膏、(CNH4)2HPO4為復(fù)合氮源，于30℃條件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)3d。將各處理的發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心10min后，收集上清液，分別測(cè)定酶活力。
1.2.4發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)菊粉酶的影響。以3%菊芋汁為碳源、2%牛肉膏和0.5%(NH4)2HPO4為復(fù)合氮源、初始pH值6.0的發(fā)酵培養(yǎng)基，對(duì)黑曲霉A24誘變菌株分別在24、26、28、30、32℃下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)72h，將各處理的發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心10min后，收集上清液，分別測(cè)定酶活力。
1.2.5發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)菊粉酶的影響。以3%菊芋汁為碳源、2%牛肉膏和0.5%(NH4)2HPO4為復(fù)合氮源，培養(yǎng)基初始pH值為 6.0，30℃下分別發(fā)酵24、48、72、96、120h，每隔24h取樣。將各處理的發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心10min后，收集上清液，測(cè)定酶活力。
1.3發(fā)酵液中還原糖含量及菊粉酶的活力測(cè)定
采用3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定發(fā)酵液中還原糖的含量，在540nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，根據(jù)葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得還原糖的含量;酶活力定義為在規(guī)定反應(yīng)條件下每分鐘轉(zhuǎn)化底物生成1μmol還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位(U/mL)，按照Pessoni等人報(bào)道的研究方法測(cè)定菊粉酶活力 。
2、結(jié)果與分析
2.1不同碳源對(duì)產(chǎn)菊粉酶的影響
試驗(yàn)結(jié)果表明，以2%菊芋汁為碳源時(shí)酶活力最高，為12.33U/mL;菊粉次之，為10.18U/mL;葡萄糖、果糖為碳源時(shí)酶活力較低，均在 2.5U/mL以下。進(jìn)一步分析不同濃度菊芋汁為碳源對(duì)產(chǎn)菊粉酶的影響，發(fā)現(xiàn)菊芋汁濃度為3%時(shí)，菊粉酶活力最高，為11.18U/mL。
2.2不同氮源對(duì)產(chǎn)菊粉酶的影響
研究結(jié)果表明，復(fù)雜有機(jī)氮源比簡(jiǎn)單無(wú)機(jī)氮源有利于菊粉酶的產(chǎn)生，且最適有機(jī)氮源為牛肉膏，無(wú)機(jī)氮源為(NH4)2HPO4，2種氮源所得到的菊粉酶活力分別為14.14、8.64U/mL。由表1可以看出，復(fù)合氮源比單純有機(jī)或無(wú)機(jī)氮源更有利于菊粉酶的產(chǎn)生，且當(dāng)牛肉膏和(NH4)2HPO4的質(zhì)量濃度分別為2%和0.5%時(shí)，菊粉酶活力最高，為19.98U/mL。
2.3培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)菊粉酶的影響
檢測(cè)不同初始pH值對(duì)黑曲霉A24誘變菌株產(chǎn)菊粉酶的影響，結(jié)果如圖1所示�？梢钥闯�，在初始pH值為3~6的范圍內(nèi)，隨著pH值升高，菊粉酶酶活增強(qiáng)，pH值為6.0時(shí)產(chǎn)菊粉酶酶活最高，達(dá)到28.83U/mL。此后隨著pH值升高，菊粉酶酶活明顯下降。
2.4發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)菊粉酶的影響
試驗(yàn)結(jié)果表明，在24~30℃范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)溫度升高菊粉酶酶活增強(qiáng)，30℃時(shí)產(chǎn)菊粉酶酶活最高，為32.51U/mL。此后，隨著溫度升高，菊粉酶酶活明顯下降，說(shuō)明菊粉酶對(duì)溫度比較敏感。因此，30℃是黑曲霉A24誘變菌株產(chǎn)菊粉酶的最適溫度(圖2)。
2.5發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)菊粉酶的影響
可以看出，隨發(fā)酵時(shí)間的增加，黑曲霉A24誘變菌株產(chǎn)菊粉酶活力增強(qiáng)，在培養(yǎng)72h后產(chǎn)菊粉酶酶活最高，為35.21U/mL。此后，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，菊粉酶酶活有下降趨勢(shì)。
3、結(jié)論與討論
近年來(lái)，利用微生物產(chǎn)菊粉酶已有不少報(bào)道，包括真菌中的黑曲霉(Aspergillusniger)、青霉(Penicilliumsp.)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)以及細(xì)菌中的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和假單孢菌(Pseudononassp.)等[5]，其中黑曲霉由于特性穩(wěn)定、易于培養(yǎng)而受到格外關(guān)注，并被普遍用來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)菊粉酶。王靜等[6]對(duì)一株黑曲霉 JNSP5-06產(chǎn)菊粉酶的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳優(yōu)化條件：2%菊粉，2%酵母膏和0.5%NH2PO4，初始pH值6.5，30℃培養(yǎng)96h，優(yōu)化后的最佳產(chǎn)菊粉酶活力達(dá)到29.73U/mL;唐艷斌等[7]曾報(bào)道黑曲霉菌株SYS-1在菊粉2%、(NH4)2HPO42%、初始pH值6.0、 30℃培養(yǎng)96h的發(fā)酵條件下產(chǎn)菊粉酶酶活最高，達(dá)到59.25U/mL。而該試驗(yàn)確定的黑曲霉A24菌株產(chǎn)菊粉酶的最適發(fā)酵條件為：菊芋汁3%、牛肉膏 2%、(NH4)2HPO40.5%、初始pH值6.0，30℃培養(yǎng)72h。在此條件下，黑曲霉A24誘變菌株發(fā)酵液中菊粉酶活力最高，為 35.21U/mL。試驗(yàn)所確定的最適氮源與王靜等[6]的結(jié)果不一致，培養(yǎng)時(shí)間比上述報(bào)道縮短了24h，可能是因?yàn)椴煌觊g存在一定差異所致，但該試驗(yàn)結(jié)果明顯能減少成本，在生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力更大。
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