胃腸舒對(duì)大鼠胃腸平滑肌細(xì)胞鈣離子濃度的影響
作者：宋曉冬 楊成 劉孟安 孫豐潤(rùn) 劉穎 張麗霞 劉文波
【摘要】 目的 通過(guò)測(cè)定體外培養(yǎng)的SD大鼠胃腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度，觀察胃腸舒對(duì)SD大鼠胃腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的影響，探討胃腸舒促胃腸動(dòng)力的作用機(jī)制。方法 離體培養(yǎng)SD大鼠胃腸平滑肌細(xì)胞，應(yīng)用特異性Ca2+熒光探針Fura-2AM負(fù)載細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)游離Ca2+濃度。結(jié)果 胃腸舒在25、50、100 mg/ml 時(shí)均可升高胃腸平滑肌游離Ca2+濃度，且隨劑量增加而加強(qiáng)。結(jié)論 胃腸舒具有升高胃腸平滑肌細(xì)胞游離Ca2＋的作用，Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)第二信使可能參與了胃腸舒促進(jìn)胃腸平滑肌細(xì)胞的動(dòng)力機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】 胃腸舒；胃腸平滑肌細(xì)胞；Ca2+濃度 ；Fura-2AM；激光共聚焦顯微鏡
【Abstract】 Objective To observe Weichangshu on free Ca2+ concentration in gastrointestinal smooth muscle cell and explore its mechanism through determining free ［Ca2+］i concentration in rat gastrointestinal smooth muscle cell.Methods SD rat gastrointestinal smooth muscle cells were cultured and loaded with Fura-2AM.［Ca2+］i was measured by fluorescent intensity in each group cell with laser scanning confocal microscope. Results 25, 50, 100 mg/ml Weichangshu could elevate ［Ca２＋］i in gastrointestinal smooth muscle. The level of ［Ca２＋］i acted in dose-dependent. Conclusion The data indicated Weichangshu could increase ［Ca２＋］i in gastrointestinal smooth muscle cells. Ca２＋ as an intracellular second messenger, might be involved in the mechanism by which Weichangshu promoted the motility of gastrointestinal smooth muscle cells.
【Key words】 Weichangshu,gastrointestinal smooth muscle cells,［Ca２＋］i,Fura-2AM,laser scanning confocal microscope
胃腸運(yùn)動(dòng)障礙型疾病是臨床多發(fā)病，多與胃腸蠕動(dòng)功能減弱有關(guān)，是一類無(wú)法用解剖結(jié)構(gòu)異常來(lái)解釋的臨床疾病，其主要病理生理基礎(chǔ)為胃排空延遲及小腸傳輸功能障礙［１,２］，現(xiàn)臨床最常用的促胃腸動(dòng)力藥促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)雖然有較好療效，但其副作用如藥理作用受限、催乳素增加、焦慮、激動(dòng)、運(yùn)動(dòng)性不安、共濟(jì)失調(diào)、腹瀉、腹痛等不可忽視。目前胃腸運(yùn)動(dòng)障礙型疾病由于發(fā)病機(jī)制尚不清楚［3,4］，其藥物的研發(fā)受到限制，因此研究該類疾病的調(diào)控機(jī)制，為開(kāi)發(fā)中藥新藥提供科學(xué)的數(shù)據(jù)非常重要［5］。
胃腸舒是本課題組研究人員根據(jù)《傷寒論》大承氣湯、小承氣湯、調(diào)胃承氣湯三方化裁，取大黃、枳殼、甘草組方，經(jīng)臨床反復(fù)藥物篩選研制而成的純中藥制劑，可起到有效促進(jìn)胃腸動(dòng)力的作用［6,7］。本研究選取SD大鼠胃腸組織進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，構(gòu)建胃腸平滑肌細(xì)胞模型，不同濃度的胃腸舒作用后，測(cè)定用藥后胃腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化，初步探討了胃腸舒促進(jìn)胃腸動(dòng)力的分子機(jī)制。
1 材料與方法
1.1 材料 胃腸舒由濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室提供；西沙必利由浙江京新藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)；標(biāo)準(zhǔn)SD大白鼠由煙臺(tái)綠葉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自GiBco公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料公司；Fura-2AM Ca2+熒光探針購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；牛血清白蛋白購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；HERA CO2培養(yǎng)箱；TCS SPE 激光掃描共聚焦顯微鏡。
1.2 方法
1.2.1 離體胃腸平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)：選擇標(biāo)準(zhǔn)SD大白鼠，體質(zhì)量180～200 g，雌雄各半，乙醚麻醉，剖腹后迅速剪取胃體、空腸組織，PBS清洗后剪碎，去除上清液，重復(fù)清洗2～3次。將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液，加入0.25％胰蛋白酶，在4 ℃孵育6～18 h。移棄組織碎片中的胰蛋白酶，在37 ℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片20到30 min。待小塊組織完全消化溶解后，過(guò)200目網(wǎng)，1 000 r/min離心7 min。棄上清液，向細(xì)胞沉淀中加入新鮮配制含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打，后按每瓶(25 ml)3×104活細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶里，放入37°C孵箱里靜置培養(yǎng)待測(cè)，CK×41倒置相差顯微鏡觀察拍照。
1.2.2 平滑肌細(xì)胞的鑒定：將處理好的蓋玻片，放入6孔板使之與孔底貼合緊密，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞生長(zhǎng)至第5代吸去培養(yǎng)液，先用PBS洗滌已貼壁蓋玻片2～3次。95%酒精室溫固定20 min，PBS洗2～3次。0.1% TritonX-100室溫孵育20～30 min增強(qiáng)細(xì)胞通透性。正常羊血清于37℃封閉20 min。滴加一抗兔抗鼠α-actin單克隆抗體（1∶200，購(gòu)自Sigma公司）室溫過(guò)夜，滴加二抗羊抗兔FITC-IgG（1∶100），37 ℃孵育2 h，倒置熒光顯微鏡（波長(zhǎng)500 nm）觀察拍照。
1.2.3 胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定：實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為空白對(duì)照組、西沙必利對(duì)照組（0.51 mg/ml）、胃腸舒小劑量組Ⅰ組（25 mg/ml）、胃腸舒中劑量組Ⅱ組（50 mg/ml）、胃腸舒大劑量組Ⅲ組（100 mg/ml）。D-Hanks液吹打6孔板中培養(yǎng)的胃腸平滑肌細(xì)胞，用移液槍吸取1 ml細(xì)胞懸液于1.5 ml離心管中進(jìn)行Fura-2AM熒光探針的負(fù)載。胞內(nèi)鈣離子測(cè)定方法參考文獻(xiàn)［7］方法，稍有改進(jìn)。將細(xì)胞懸液常溫離心洗滌950 r/min×5 min×3次，棄上清液。避光加入50 μl濃度為10 μmol/L（使用濃度）的Fura-2AM，37℃避光孵育負(fù)載細(xì)胞40～50 min，輕輕搖動(dòng)，以加速Fura-2AM進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中注意用鋁箔包嚴(yán)。950 r/min離心5 min終止孵育，棄上清液。在沉淀中加入D-Hanks液，離心洗滌950 r/min×5 min×3次，洗去胞外殘存的Fura-2AM，棄上清液。D-Hanks液吹打?yàn)榧?xì)胞懸液進(jìn)行激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)。檢測(cè)之前，吸取少量細(xì)胞懸液，滴片，加蓋蓋玻片。激光共聚焦顯微鏡下立即掃描檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm）。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以x±s表示，胃腸舒各濃度組與空白對(duì)照組及西沙必利對(duì)照組間比較用方差分析，各組間兩兩比較。
2 結(jié)果
2.1 胃腸平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)及其鑒定 倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞形狀橢圓形，束狀排列，密集與稀疏處相互交錯(cuò)呈“峰谷”狀，峰處為多層細(xì)胞，谷處為單層或雙層細(xì)胞，培養(yǎng)4 d后細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底。為確定胃腸平滑肌細(xì)胞離體分離培養(yǎng)成功，用兔抗鼠а-actin mAb單克隆抗體進(jìn)行了鑒定，細(xì)胞經(jīng)漂洗后置于熒光顯微鏡下觀察，負(fù)載了FITC的細(xì)胞經(jīng)500 nm的波長(zhǎng)激發(fā)下產(chǎn)生熒光，可見(jiàn)95% 以上的細(xì)胞顯示了陽(yáng)性熒光標(biāo)記，說(shuō)明離體培養(yǎng)的平滑肌細(xì)胞成功。
圖1 胃腸平滑肌細(xì)胞的鑒定×400
2.2 激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)胃腸舒對(duì)胃腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響
2.2.1 各組胃腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度值比較：測(cè)定各藥物組選定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值，計(jì)算均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s），即為該藥物濃度細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度。對(duì)胃腸平滑肌細(xì)胞各藥物組中細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度兩兩比較：胃腸舒片各濃度組與空白對(duì)照組相比，均存在極顯著差異(P＜0.01)，即胃腸舒片能明顯升高胃腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度（表1）。胃腸舒片各濃度組與西沙必利對(duì)照組比較：胃腸舒25 mg/ml組與西沙必利0.51 mg/ml組差異不顯著(P＞0.05)，即兩者在升高平滑肌胞內(nèi)Ca2+濃度方面效果相當(dāng)。胃腸舒片50 mg/ml組與西沙必利0.51 mg/ml組差異顯著(P＜0.05)，即胃腸舒片50 mg/ml組在升高平滑肌胞內(nèi)Ca2+濃度方面，效果優(yōu)于西沙必利0.51 mg/ml組。胃腸舒100 mg/ml組與西沙必利0.51 mg/ml組相比，存在極顯著差異(P＜0.01)，胃腸舒100 mg/ml組在升高平滑肌胞內(nèi)Ca2+濃度方面效果明顯優(yōu)于西沙必利0.51 mg/ml組（表1）。表1 胃腸舒組與對(duì)照組細(xì)胞熒光強(qiáng)度值比較與空白對(duì)照組比較*P＜0.01, 與西沙必利組比較△P＜0.05
2.2.2 激光共聚焦顯微鏡拍攝各組胃腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度圖：圖2是在激光共聚焦顯微鏡下觀察到的胃腸舒對(duì)胃腸平滑肌細(xì)胞的影響，圖中照片明顯顯示胃腸舒組胃腸平滑肌細(xì)胞的Ca2+流高于空白對(duì)照組和西沙必利組，且隨著胃腸舒用藥濃度的增加對(duì)Ca2+流的影響越大。
3 討論
胃腸動(dòng)力障礙疾病是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)疾病之一，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率較高，且有日漸上升趨勢(shì)。目前認(rèn)為，胃腸動(dòng)力障礙性疾病的發(fā)生可能不僅與中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)，還可能與離子濃度、離子通道等有關(guān)，因此，對(duì)該病發(fā)病機(jī)制中離子濃度和離子通道的變化研究十分重要。
目前已知離子通道的信號(hào)傳遞是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控胃腸道平滑肌細(xì)胞活動(dòng)的一個(gè)重要途徑， 有賴于Ca2+、Na+、K+、Cl-等多種離子的存在［8～14］， 其中 Ca2+是胃腸平滑肌的興奮-收縮耦聯(lián)者，當(dāng)胞質(zhì)內(nèi) Ca2+ 濃度至一定水平時(shí)，即使沒(méi)有膜電位變化，也可觸發(fā)胃腸平滑肌收縮。L 型 Ca2+通道是 Ca2+進(jìn)入胃腸細(xì)胞的主要通道， 應(yīng)用調(diào)控離子通道類藥物將是今后治療胃腸動(dòng)力類藥的新方向。胃腸道神經(jīng)系統(tǒng)中最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)是乙酰膽堿（ACh），可以與毒蕈堿的 M2 型受體結(jié)合。副交感神經(jīng)節(jié)后纖維釋放 Ach 作用于平滑肌 M受體后可開(kāi)放質(zhì)膜上 L型 Ca2+通道, 產(chǎn)生內(nèi)流致肌收縮［15～18］。
胃腸平滑肌細(xì)胞胞漿游離Ca2+在平滑肌細(xì)胞收縮與舒張過(guò)程中起重要的“第二信使”作用。一般認(rèn)為，平滑肌收縮和舒張活動(dòng)與胞內(nèi)鈣離子濃度變化密切相關(guān)：高濃度Ca2+引起平滑肌收縮,低濃度Ca2+引起平滑肌舒張。應(yīng)用Ca2+敏感的熒光探針Quin-2、Fura-2、Indo-l 及Fluo-3 測(cè)定顯示平滑肌細(xì)胞靜息時(shí)胞內(nèi)Ca2+ 濃度為120～270 nmol/ L ，激活時(shí)可達(dá)500～700 nmol/ L。肌細(xì)胞膜系統(tǒng)在維持細(xì)胞內(nèi)外Ca2+ 正常濃度中起重要作用,通過(guò)質(zhì)膜和肌質(zhì)網(wǎng)膜的移動(dòng)調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度。平滑肌收縮時(shí)的鈣離子來(lái)源于細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流或細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)Ca2+釋放(主要是肌質(zhì)網(wǎng))。生理?xiàng)l件下,胞外Ca2+可通過(guò)質(zhì)膜鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞；肌質(zhì)網(wǎng)貯存Ca2+，也可通過(guò)IP相關(guān)通道或通過(guò)Ca2+誘發(fā)的Ca2+釋放進(jìn)入胞漿。平滑肌細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流和細(xì)胞內(nèi)貯存Ca2+釋放相互影響,細(xì)胞外Ca2+通過(guò)L 型鈣離子通道內(nèi)流可誘發(fā)鈣離子誘導(dǎo)的鈣離子釋放(CICR)，相反，細(xì)胞內(nèi)貯存Ca2+減少亦可引發(fā)細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞(CRAC)。CRAC 多通過(guò)非選擇性離子通道，且不被 L型鈣離子通道拮抗劑拮抗［19，20］。
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)選取SD大鼠胃腸平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)，不同濃度藥物作用后，熒光探針Fura-2AM標(biāo)記培養(yǎng)大鼠胃平滑肌細(xì)胞內(nèi)的游離Ca2+ ，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)到了胃腸平滑肌細(xì)胞熒光強(qiáng)度值：胃腸舒片100 mg/ml組：胃134.543±15.328、腸157.173±18.270；胃腸舒片50 mg/ml組：胃 68.585±6.299、腸 89.703±24.945；胃腸舒片25 mg/ml組：胃 51.125±20.358、腸58.455±8.781；西沙必利0.51 mg/ml：胃 48.963±7.871、腸 49.825±14.063；空白對(duì)照組：胃18.350±6.528、腸 28.150±4.213，從熒光強(qiáng)度值顯示胃腸舒組與空白對(duì)照組相比，能明顯提高胃腸平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 的濃度，并且效果優(yōu)于西沙必利組，推測(cè)Ca2+濃度的增高可能參與了胃腸舒促胃腸動(dòng)力的作用。
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