88Arg IL-2的克隆構(gòu)建及原核表達(dá)
作者：孟林 劉明軍 王斌 錢冬萌
【關(guān)鍵詞】 白細(xì)胞介素2;基因突變;原核表達(dá);蛋白質(zhì)印跡法;MTT比色法
�。壅菽康� 構(gòu)建88Arg IL-2的重組克隆，并在大腸桿菌中表達(dá)。方法 根據(jù)天然IL-2的基因序列設(shè)計(jì)含目的突變位點(diǎn)的引物，經(jīng)PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)獲得 88Arg IL-2的重組克隆，插入原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T-2中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌DH5α中表達(dá)88Arg IL-2與GST的融合蛋白。結(jié)果所表達(dá)的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為 42 000 。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，該蛋白具有與親本IL-2相同的抗原性。MTT比色結(jié)果表明，88Arg IL-2可促使IL-2依賴細(xì)胞株CTLL-2生長(zhǎng)，具有與親本IL-2相近的生物學(xué)活性。結(jié)論 成功構(gòu)建了88Arg IL-2的重組克隆，在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)出融合蛋白，并且具有生物學(xué)活性。
�。坳P(guān)鍵詞］ 白細(xì)胞介素2;基因突變;原核表達(dá);蛋白質(zhì)印跡法;MTT比色法
�。跘BSTRACT］ObjectiveTo construct clone of88Arg IL-2 and express it in Escherichia coli. MethodsSite-specific mu-tated primers were designed according to natural IL-2 DNA sequence.88Arg IL-2 gene was amplified using PCR. Then the88Arg IL-2 gene was inserted into expression vector pGEX4T-2 and induced by IPTG to express the protein in E. coli DH5α. ResultsThe molecular weight of fusion protein was 42 000. Western blotting test revealed that it had good specificity to anti-IL-2. The result of MTT assay indicated that88Arg IL-2 could stimulate the proliferation of CTLL-2 which was IL-2-dependent cell strain. Conclusion88Arg IL-2 has been cloned; the fusion protein is expressed in prokaryotic expression system with biologic activity.
�。跭EY WORDS］interleukin-2; gene mutation; prokaryotic expression; immunoblotting; MTT assay
白細(xì)胞介素2（IL-2）可誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖分化，增強(qiáng)CTL的細(xì)胞毒性，促進(jìn)NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞增殖并增強(qiáng)其活性等［1～3］。臨床上已經(jīng)開始使用基因重組IL-2（rIL-2）作為治療多種惡性腫瘤的藥物［3］。但I(xiàn)L-2對(duì)靶受體的選擇性不高，當(dāng)與NK細(xì)胞表面的中度親和力受體結(jié)合時(shí)，會(huì)導(dǎo)致NK細(xì)胞的過度活化，產(chǎn)生過量腫瘤壞死因子（TNF），從而導(dǎo)致系統(tǒng)毒性。因此，利用IL-2基因定位誘變技術(shù)，獲得既保持其原有生物學(xué)活性又增強(qiáng)對(duì)靶細(xì)胞作用特異性的變構(gòu)體就顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)利用PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)，將編碼IL-2的第88位酸性氨基酸天冬酰胺（Asn）變構(gòu)為堿性氨基酸精氨酸（Arg），并將其構(gòu)建成穩(wěn)定的原核表達(dá)克隆，在此基礎(chǔ)上對(duì)變構(gòu)IL-2（88Arg IL-2）融合蛋白進(jìn)行了抗原性和生物學(xué)活性測(cè)定，為進(jìn)一步研究其受體結(jié)合特異性，并將其開發(fā)成為新型的抗腫瘤免疫藥物奠定基礎(chǔ)。
1 材料和方法
1.1 材料與試劑IL-2克隆由本教研室構(gòu)建。原核表達(dá)載體pGEX4T-2、菌株E.coli JM109和E.coli DH5α均由本教研室保存。pGEM-T Easy載體、PCR試劑、T4 DNA連接酶、PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購(gòu)自Pro-mega公司。rhIL-2購(gòu)自晶美生物公司。Anti-hu-manIL-2（Monoclonal antibody）購(gòu)自PeproTech EC Ltd。Goat Anti-mouse IgG （γ chain specific）購(gòu)自Southern Biotech Associates， Inc。MTT為Pro-mega公司分裝，TRIZOL試劑為Invitrogene公司產(chǎn)品。
1.2 方法
1.2.188Arg IL-2基因克隆的構(gòu)建及序列測(cè)定 用 于構(gòu)建IL-2基因克隆的引物為上游引物（P3）:5′- ACAATGTACAGGATGCAACT-3′，下游引物（P4）: 5′-TAATTATCAAGTTAGTGTTGA-3′。設(shè)計(jì)含突變位點(diǎn)的反向互補(bǔ)引物P5、P6。P5:5′-GACT-TAATCAGCCGTATCAACGTAATA-3′，P6: 5′-TATTACGTTGATACGGCTGATTAA-GTC-3′。使用上述4條引物經(jīng)PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)得到變構(gòu)基因片段P3/P6、P5/P4，兩純化片段部分互補(bǔ)，以此為模板， 以P3、P4為引物行PCR擴(kuò)增獲得88Arg IL-2基因。PCR產(chǎn)物純化后與T-Easy Vector連接，重組質(zhì)粒標(biāo)記為T-Easy/IL-2（sa），轉(zhuǎn)化至E.coli JM109，選擇陽(yáng)性克隆，送至上海生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。
1.2.2pGEX4T-2/88Arg IL-2重組表達(dá)克隆構(gòu)建和鑒定 根據(jù)88Arg IL-2基因序列，設(shè)計(jì)合成2條引物，IL-2上游引物:5′-GTCAGAATTCCCGCAC-CTACTTCAAGTTCGACA-3′，IL-2下游引物:5′-CACTGTCGACTCAAGTTAGTGTTGAGATG-ATG-3′。其中在IL-2上游引物的5′端引入EcoR Ⅰ的酶切位點(diǎn)和4個(gè)保護(hù)堿基，IL-2下游引物的5′端引入終止密碼子、Sal Ⅰ的酶切位點(diǎn)和4個(gè)保護(hù)堿基。PCR產(chǎn)物應(yīng)用Promega公司W(wǎng)izard DNA Clean-up純化后用EcoR Ⅰ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切后回收，同時(shí)對(duì)表達(dá)載體pGEX4T-2也用上述酶進(jìn)行雙酶切后回收，用T4 Ligase將兩者連接后，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中構(gòu)建pGEX4T-2/88Arg IL-2重組 表達(dá) 克隆，再對(duì)重組載體進(jìn)行EcoR Ⅰ 和Sal Ⅰ 酶切鑒定。
1.2.388Arg IL-2融合蛋白的表達(dá)和純化 挑取含pGEX4T-2/88Arg IL-2重組質(zhì)粒的E.coli DH5α接種于LB培養(yǎng)液中（含100 mg/L氨芐青霉素），在37 ℃下振蕩培養(yǎng)至 A600約為0.6。加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1 mmol/L，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。收集菌液，將菌斑超聲裂解。離心分離上清和沉淀，分別在 120 g/L SDS-PAGE凝膠中電泳。將電泳后的凝膠用考馬斯亮藍(lán)染液染色，觀察表達(dá)情況。另按上述方法經(jīng)超聲裂解細(xì)菌，收獲大量上清液，加入GST Fusion Protein Purification bead振蕩30 min濃縮純化，以得到純化的pGEX4T-2/88Arg IL-2蛋白。
1.2.488Arg IL-2融合蛋白的Western blot鑒定 將電泳后的含表達(dá) 蛋白和標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)分子質(zhì)量蛋白Marker的凝膠用電轉(zhuǎn)儀（BIO-RAD公司產(chǎn)品）轉(zhuǎn)至PVDF膜上。電轉(zhuǎn)結(jié)束后，切下Marker膜條，用麗春紅染液染色備用。余下的膜條，用IL-2單克隆抗體（一抗）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（二抗）在轉(zhuǎn)移后的PVDF膜上行酶免疫固定檢測(cè)88Arg IL-2的抗原性。
1.2.5MT T比色法檢測(cè)88Arg IL-2生物學(xué)活性 用含體積 分?jǐn)?shù)0.1胎牛血清的RPMI 1640液體調(diào)整CTLL-2細(xì)胞濃度為（3～5）×108 /L，96孔板中每孔加100 μL，將純化后的變構(gòu)IL-2定量到5 g/L，然后以此為原液進(jìn)行倍比稀釋，設(shè)7個(gè)稀釋度， 每個(gè)稀釋度做3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照孔（每 100 μL中 加入10 U rhIL-2標(biāo)準(zhǔn)品）、空白對(duì)照（加入培養(yǎng)液），37 ℃ CO2 培養(yǎng)24～48 h，待空白對(duì)照孔細(xì)胞95%死亡時(shí)，加入MTT 20 μL（50 g/L），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后 ，每孔再加入二甲基亞砜（DMSO） 200 μL終 止反應(yīng)，微量振蕩器振蕩10 min，在酶標(biāo)儀上檢測(cè) 570 nm 波長(zhǎng)處各孔吸光度（ A ）。
2 結(jié)果
2.188Arg IL-2基因PCR產(chǎn)物鑒定及序列測(cè)定88Arg IL-2的PCR產(chǎn)物為472 bp（圖1）�；驕y(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，插入的基因序列完全正確，并保證了插入基因的正確閱讀。
2.2pGEX4T-2/88Arg IL-2重組表達(dá)載體的酶切鑒定 pGEX4T-2/88Arg IL-2重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定、EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切鑒定后獲得了大小相符的片段（圖1）。
2.3重組質(zhì)粒pGEX4T-2/88Arg IL-2在E.coli DH5α中的表達(dá)和初步純化 將含pGEX4T-2/88Arg IL-2重組體的E.coli DH5α經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，并用超聲粉碎處理菌體后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，同時(shí)設(shè)空菌、空質(zhì)粒對(duì)照。結(jié)果在相對(duì)分子質(zhì)量為42 000位置有明顯的融合蛋白表達(dá)條帶，并確認(rèn)表達(dá)的融合蛋白大部分以包涵體的形式存在于菌體中（見圖2）。經(jīng)GST Fusion Protein Purification bead純化后的融合蛋白電泳條帶見圖3。
2.4 Western blot鑒定 Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，在相對(duì)分子質(zhì)量為 42 000處 ，未經(jīng)純化的融合蛋白和純化的融合蛋白均有一特異的棕色條帶（圖4），證明 88Arg IL-2融合蛋白與市售IL-2單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)， 說明純化的88Arg IL-2融合蛋白保持天然的抗原性。
圖1 88Arg IL-2基因PCR產(chǎn)物及pGEX4T-2/88Arg IL-2重組質(zhì)粒的酶切鑒定（略）
M為DL 2 000 Marker;①為IL-2基因;②為P5/P4片段;③為P3/P6片段;④為88Arg IL-2基因克隆插入T-A載體后PCR鑒定結(jié)果;⑤為pGEX4T-2/88Arg IL-2重組表達(dá)載體EcoRⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定
圖2 SDS-PAGE電泳結(jié)果 （略）
�、贋镈H5α誘導(dǎo)前;②為pGEX4T-2-DH5α誘導(dǎo)前;③為重組質(zhì)粒-DH5α誘導(dǎo)前;④為DH5α誘導(dǎo)后;⑤為pGEX4T-2-DH5α誘導(dǎo)后;⑥為重組質(zhì)粒-DH5α誘導(dǎo)后
圖3 融合蛋白純化的結(jié)果 （略）
M為蛋白Marker;①為重組質(zhì)粒-DH5α誘導(dǎo)前;②為重組質(zhì)粒-DH5α誘導(dǎo)后;③為純化的融合蛋白
圖4 Western blot鑒定結(jié)果 （略）
M為蛋白Marker;①為誘導(dǎo)細(xì)菌總蛋白的印跡;②為純化融合蛋白印跡
表1 不同稀釋度88Arg IL-2的吸光度（略）
3 討論
IL-2是20世紀(jì)90年代獲準(zhǔn)上市的重組基因工程藥物。在自然狀態(tài)下，IL-2具有免疫活性，可以刺激機(jī)體的CTL細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，這種 內(nèi)源性的干擾素可以使單核-巨噬細(xì)胞發(fā)生活化，產(chǎn)生TNF-α，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的程序性死亡。IL-2對(duì)于其靶受體的選擇性不高，在與中度親和力受體結(jié)合后，會(huì)導(dǎo)致NK細(xì)胞的過度活化，從而產(chǎn)生過量TNF-α，殺傷正常細(xì)胞。近年來，國(guó)內(nèi)外將研究熱點(diǎn)放在對(duì)IL-2進(jìn)行基因變構(gòu)上，以期獲得高活性和高特異性的突變IL-2替代品。JU等［4］通過定位誘變得到50多種不同的突變體，分析它們的活性后證實(shí)在IL-2分子中有3段序列對(duì)維持其活性是必需的:①N端第1～20位氨基酸;②C端第123～133位氨基酸;③58位和105位Cys。N端、C端及中央的30～60位氨基酸組成了IL-2與其受體的結(jié)合部位，這些部位的氨基酸突變均可影響其受體的識(shí)別。ARAKAWA等［5］將IL-2分子中第125位的Cys突變成Ala或Ser，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌后產(chǎn)生的IL-2具有與天然IL-2分子相同或更高的活性，而且生產(chǎn)方便。目前國(guó)外125Ser-IL-2已經(jīng)FDA批準(zhǔn)生產(chǎn)，125Ala-IL-2也已批準(zhǔn)臨床試用。但這些點(diǎn)突變未能明顯改善與受體特異性結(jié)合的問題。ARMEN等［6］研究發(fā)現(xiàn)，在基因水平對(duì)IL-2進(jìn)行特定位點(diǎn)的定位誘變，將編碼幾個(gè)特定位點(diǎn)的酸性氨基酸變?yōu)閴A性氨基酸，可以顯著改變與IL-2受體α、β、γ鏈結(jié)合的親和力，從而增強(qiáng)變構(gòu)IL-2與機(jī)體抗腫瘤免疫的主要細(xì)胞―― ―CTL細(xì)胞的活化，而減弱非特異性的NK細(xì)胞殺傷作用。本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建了變構(gòu)IL-2（88Arg IL-2）的基因克隆，并在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)了該蛋白的融合蛋白且獲得了純化的融合蛋白。該88Arg IL-2與目前市售IL-2單克隆抗體可發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)，提示該點(diǎn)突變對(duì)IL-2的抗原性沒有影響。在此基礎(chǔ)上，利用MTT比色法檢測(cè)了 88Arg IL-2促進(jìn)IL-2依賴CTLL-2細(xì)胞株生長(zhǎng)的作用，結(jié)果顯示，88Arg IL-2與天然IL-2有相近的生物學(xué)活性。但在本研究中，未能獲得HPLC純的非融合88Arg IL-2，暫時(shí)不便比較 88Arg IL-2與天然IL-2的活性高低。這將在今后的研究工作中進(jìn)一步補(bǔ)充完善，并將探索比較其在激活CTL細(xì)胞、NK細(xì)胞、LAK細(xì)胞等方面的作用優(yōu)勢(shì)。
�。蹍⒖嘉墨I(xiàn)］
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