焦爐工血清p53蛋白的檢測分析

【摘要】  目的 探討職業(yè)接觸焦爐逸散物的焦爐工人血清p53蛋白的表達水平及其在肺癌高危人群篩檢中的意義。方法 運用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（Westernblot），對接觸組118例和對照組50例人群的血清p53蛋白進行檢測，比較兩組血清p53蛋白的表達水平。結(jié)果 接觸組不同工齡組、不同作業(yè)地點間p53蛋白的表達水平具有統(tǒng)計學意義（P﹤0?05）。結(jié)論 經(jīng)常大量接觸焦爐逸散物可使p53蛋白的表達水平升高，增加p53基因異常的危險性，從而使焦爐工患肺癌的危險性增加。 
【關(guān)鍵詞】  焦爐逸散物；蛋白免疫印跡；p53蛋白
     【Abstract】 Objective Serum p53 protein overexpression was detect in coke oven workers to explore the biomarker of early diagnosis of lung cancer.Methods Western blot was used for determing the level of p53.Serum p53 were compared between two groups. Results Compared with the control group, p53 levels in the different exposed group and different operating points increased significantly（P<0?05）,and the expression of p53 increased gradually in the exposed group with years of service. Conclusion The results suggested that coking oven emissions (COE) were likely to cause mutation of p53 gene and increasing the incidence of lung cancer.
    【Key words】 coking oven emissions (COE)， Westernblot， p53 protein
    尋找和確定合適的早期監(jiān)測指標一直是職業(yè)性腫瘤高危人群篩檢的重要研究課題。新近發(fā)現(xiàn)抑癌基因p53與職業(yè)性肺癌密切相關(guān)，其改變可發(fā)生在癌變的早期階段，并于血清中出現(xiàn)相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物［１］。多環(huán)芳烴職業(yè)接觸者是肺癌發(fā)生的高危人群。本調(diào)查采用蛋白質(zhì)印跡技術(shù)(Westernblot)檢測多環(huán)芳烴職業(yè)接觸者——焦爐工血清p53蛋白的表達情況，以探討血清p53蛋白作為焦爐工早期篩查肺癌指標的意義。
    1 對象與方法
    1.1 研究對象 將某有限公司焦化廠煉焦車間的2004年3月在冊職工（均為男性），按工齡分為3層，即﹤10年、10年～、20年～，再以等比例抽樣法在各層抽取31、53、34人，共118人，組成接觸組。對照組選自工作地點距該焦化廠3 000 m以外，且在3個月內(nèi)未去過焦化廠的工廠男性醫(yī)務(wù)人員50名組成對照，均未曾有任何職業(yè)致癌物接觸史。
    1.2 樣本收集與處理 于清晨空腹采集每位調(diào)查對象的肘靜脈血2 ml，不抗凝，2 000 r/min常溫離心30 min，吸取血清至1.5 ml干凈離心管中，并采用雙縮脲法測定血清樣品的總蛋白濃度，用雙蒸水將樣品濃度調(diào)至3.5 mg/ml，-20℃保存待測。
    1.3 實驗方法 Westernblot方法檢測血清p53蛋白,按文獻［２］的方法對p53進行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)? Ｆ渲幸豢褂猛每谷藀53多克隆抗體(0?5%Tris飽和鹽水（TBS）按1∶500稀釋，美國Santa Cruz公司)， TBS中洗膜5 min×3次。二抗為辣根過氧化物酶標記羊抗兔抗體(0.5% TBS按1∶400稀釋，美國Sigma)， TBS中洗膜5 min×3次。二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色5 min，大量雙蒸水清洗3次終止顯色。結(jié)果掃描保存，并用捷達801系列凝膠電泳圖象分析系統(tǒng)分析p53蛋白水平 (單位:積分吸光度)。
    1.4 統(tǒng)計分析 對實驗室結(jié)果經(jīng)核實確系無誤后建立數(shù)據(jù)庫，用SPSS10?0統(tǒng)計軟件對焦爐工不同工齡組間、不同作業(yè)地點的p53蛋白表達水平進行單因素方差分析。
    2 結(jié)果
    2.1 研究對象的均衡性 118名焦爐工的平均年齡為（36.28±7.90）歲，50名對照組的平均年齡為（37?04±9?74）歲，接觸組和對照組工人均為漢族；兩組在年齡,經(jīng)濟水平分布上無顯著性差異（t值分別為-0?528、1?637，P﹥0?05）,文化程度構(gòu)成差異無顯著性（χ2=2?633，P﹥0?05），可見兩組均衡性較好。
    2.2 生產(chǎn)環(huán)境空氣中有毒物質(zhì)檢測結(jié)果 作業(yè)場所環(huán)境監(jiān)測結(jié)果見表1 ，各測定地點粉塵和B［a］P濃度都遠遠高于國家衛(wèi)生標準，以爐頂為最高。表1 焦爐作業(yè)區(qū)不同地點空氣B［a］P、粉塵濃度
    2.3.1 血清蛋白經(jīng)SDS?PAGE電泳，應(yīng)用考馬斯亮藍R250染色，按10 μl/道加樣，蛋白量約為35 μg ，接觸組在條帶上明顯高于對照組，見圖1。Westernblot分析結(jié)果，根據(jù)與預染蛋白Marker分子量的比較，在62 kD和48 kD之間有單一條帶即為p53。
    2.3.2 不同工齡組與對照組血清p53表達水平比較：經(jīng)檢驗，接觸組與對照組p53蛋白的表達水平差異有統(tǒng)計學意義（P﹤0?05），見表2。表2 不同工齡組與對照組血清p53平均水平比較

    2.3.3 不同作業(yè)地點與對照組血清p53表達水平比較：作業(yè)區(qū)不同地點的p53蛋白的表達水平明顯高于對照組（P﹤0?05），其中，爐頂?shù)膒53蛋白的表達水平高于機側(cè) （P﹤0?05），其余各地點間差異無顯著性，見表3。表3 不同地點與對照組血清p53平均水平比
    3 討論
    Alian［３］的研究認為p53基因是環(huán)境和職業(yè)致癌作用的靶基因。COE的主要成分是多環(huán)芳烴化合物（PAHs），PAHs的主要致癌成分為苯并［ａ］芘，其最終活性產(chǎn)物能在p53基因的突變熱點區(qū)域與DNA形成加合物，造成p53基因突變。如果p53基因發(fā)生突變，它所表達的p53蛋白的穩(wěn)定性就會增加，在細胞內(nèi)發(fā)生堆積，分泌到血液中，出現(xiàn)過量表達。由于p53蛋白可以分泌到血液中，所以檢測血清p53蛋白可以反映體內(nèi)p53基因表達的情況［４］，提示機體發(fā)生腫瘤可能性的大? ６苑偉└呶Ｈ巳旱難芯勘礱鰨?恍┚?＝喲ブ擄┪锏鬧耙等巳海?緗喲ナ?蕖⒘で�、�醯墓と搜?錺53蛋白的過表達率要高于對照組非暴露人群［５］。煉焦工齡常是決定發(fā)病的重要因素，此次調(diào)查在不同工齡組p53的表達水平有顯著性差異，隨著工齡的增加，p53的表達量增加；不同作業(yè)地點p53的表達水平不同，爐頂工明顯高于機側(cè)工，有統(tǒng)計學意義（P﹤0?05），工齡和作業(yè)地點兩方面結(jié)果反映了長期暴露于含有高濃度多環(huán)芳烴的作業(yè)環(huán)境,大量苯并［ａ］芘反復持續(xù)進入體內(nèi),造成組織細胞p53基因損傷,表現(xiàn)為部分暴露者血清p53蛋白水平異常增高。p53作為抑癌基因，其蛋白表達產(chǎn)物在細胞增殖過程中的過量表達，可作為肺癌高危人群的篩檢指標，用于焦爐工職業(yè)病體檢中，有利于焦爐工的健康監(jiān)護，為煤焦瀝青作業(yè)者的勞動保護提供科學依據(jù)。
【參考文獻】
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［2］ 薩姆布魯克Ｊ,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T.分子克隆實驗指南［M］.北京: 科學出版社,1999:880?888.

［3］ Alian P. Selective targeting of p53 gene mutation hotspots in human by etiology:laiiy defined carcinogens［Ｊ］. Cancer Res,1991,51:185?189.

［4］ Myong NH.Tissue microarray analysis of Fas and FasL expressions in human non?small cell lung carcinomas; with reference to the p53 and bcl?2 overexpressions［Ｊ］.J Korean Med Sci,2005 ,20(5):770?776.

［5］ Morris GF, Notwick AR, David O,et al.Development of lung tumors in mutant p53?expressing mice after inhalation exposure to asbestos［Ｊ］.Chest,2004 ,125(5):85?86.

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