流式細(xì)胞術(shù)在臨床研究方面的應(yīng)用
作者：韓兆東 阮月芹 安新業(yè) 孔祥華 陳佳榮 周玉明【關(guān)鍵詞】 細(xì)胞
【關(guān)鍵詞】 流式細(xì)胞儀；臨床應(yīng)用；流式細(xì)胞術(shù)
流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry,FCM）是利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞等生物粒子的理、化及生物特性進(jìn)行分析的方法。流式細(xì)胞儀是近代細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、分子免疫學(xué)和單克隆技術(shù)、激光技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)術(shù)等學(xué)科高度發(fā)展的綜合結(jié)晶。在免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)等學(xué)科及臨床研究方面得到廣泛應(yīng)用［1］。
FC500是由美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特（BECKMAN COULTER）公司2003年推出的臨床及科研型流式細(xì)胞儀系統(tǒng)。該儀器可同時(shí)測(cè)定前向散射光（FORWARD SCATTER）、側(cè)向散射光（SIDE SCATTER）及利用一個(gè)488 nm單束激光激發(fā)五個(gè)熒光染科所產(chǎn)生的熒光信號(hào)。因此，該儀器可對(duì)各個(gè)細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)的多參量的分析。
FCM的應(yīng)用標(biāo)志著細(xì)胞學(xué)、腫瘤學(xué)、免疫學(xué)等進(jìn)入了細(xì)胞的分子水平的研究，隨著對(duì)FCM研究的日益深入，其價(jià)值已經(jīng)從科學(xué)研究走入了臨床應(yīng)用階段，在我國(guó)臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里已有著廣泛的應(yīng)用。
1 FCM在免疫學(xué)中的應(yīng)用
FCM廣泛地應(yīng)用于檢測(cè)各種免疫細(xì)胞的表面標(biāo)志及細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞因子等，通過對(duì)病人淋巴細(xì)胞各亞群數(shù)量的測(cè)定來監(jiān)控病人的免疫狀態(tài)，指導(dǎo)治療。有大量文獻(xiàn)介紹了淋巴細(xì)胞在各種疾病中的變化。正常人群T淋巴細(xì)胞CD4/CD8比值大約為2∶1，但在人體細(xì)胞免疫力低下時(shí)可出現(xiàn)比例下降甚至倒置。B細(xì)胞CD19與機(jī)體免疫球蛋白呈正相關(guān)。NK細(xì)胞反應(yīng)機(jī)體對(duì)病毒感染的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的殺傷能力及巨噬細(xì)胞的殺菌活性。FCM通過對(duì)人白細(xì)胞抗原（HLA）配型的測(cè)定可以為異體干細(xì)胞移植病人選擇出最合適的供體并進(jìn)行骨髓或器官移植后免疫狀態(tài)的監(jiān)測(cè)。外周血HLAB27的表達(dá)及其表達(dá)程度與強(qiáng)直性脊髓炎的發(fā)生有很大程度的相關(guān)性，運(yùn)用HLAB27/HLAB7雙標(biāo)記特異性單克隆抗體檢測(cè)抗原，可同時(shí)排除交叉反應(yīng)，其敏感性較傳統(tǒng)的微量細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)大大提高［2］。用FCM檢測(cè)陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿患者血細(xì)胞細(xì)胞膜上的CD55、CD59已能從病理上提供直接的證據(jù)，比傳統(tǒng)的溶血試驗(yàn)具有更高的特異性和靈敏度。用FCM檢測(cè)紅細(xì)胞、粒細(xì)胞抗體及血小板表面的相關(guān)抗體，對(duì)確診自身免疫性貧血、粒細(xì)胞減少癥及血小板減少性疾病，均具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點(diǎn)［2］。
2 FCM在血液學(xué)中的應(yīng)用
白血病分型是MIC分型的重要組成部分，也是對(duì)FAB分型的補(bǔ)充；是對(duì)白血病診斷、選擇化療方案和判斷預(yù)后的重要依據(jù)；對(duì)白血病發(fā)病機(jī)制的研究也具有重要作用。由于白血病不同系列、不同分化階段血細(xì)胞膜表面及漿內(nèi)表達(dá)不同的分化抗原，且與相應(yīng)正常骨髓細(xì)胞的表達(dá)存在差異，故應(yīng)用FCM能很好的對(duì)白血病進(jìn)行免疫分型，并能夠提供正常細(xì)胞在演變成惡性腫瘤過程中細(xì)胞基因及抗原標(biāo)志發(fā)生變化的信息，而這種變化常常是細(xì)微的，以至于常規(guī)FAB方法不能分辨。這使我們對(duì)血液腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征有了更深入和更精確的認(rèn)識(shí)。FCM還可用于血小板膜糖蛋白異常所致疾病的診斷，包括先天性或獲得性血小板的疾病，評(píng)價(jià)活化血小板程度在血栓疾病和血栓前狀態(tài)發(fā)生發(fā)展中的作用。用FCM通過對(duì)外周血網(wǎng)織血小板的測(cè)定，有助于血小板減少癥的病因?qū)W診斷�？勺鳛楣撬枰浦�、造血促進(jìn)因子和骨髓移植后骨髓血小板造血恢復(fù)有用的監(jiān)控指標(biāo)。
應(yīng)用FCM檢測(cè)某些免疫指標(biāo)，能對(duì)再生障礙性貧血的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行研究。再障是一組由不同發(fā)病機(jī)制介導(dǎo)的骨髓造血功能障礙綜合征。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明了，但越來越多的臨床和實(shí)驗(yàn)室證據(jù)表明免疫介導(dǎo)的造血抑制，是再生障礙性貧血最常見的病理之一。而且，具有免疫表型異常（如CD4/CD8倒置、CD8+活化T細(xì)胞或TCRγ，δ等異常增高）的患者臨床表現(xiàn)相對(duì)嚴(yán)重，但免疫治療相對(duì)有較好的療效。微小殘留病灶（MRD）檢查：白血病病人在獲得血液學(xué)緩解后，體內(nèi)還存在1010以下的白血病細(xì)胞。這樣少量的白血病細(xì)胞常規(guī)的顯微鏡不能檢出。在強(qiáng)化治療和維持治療后可逐步減少，但難以徹底清除，這是復(fù)發(fā)的根源。檢測(cè)MRD是決定進(jìn)一步治療策略和選擇采集外周血造血干/祖細(xì)胞自體移植及異基因骨髓移植時(shí)機(jī)的依據(jù)。
多發(fā)性骨髓瘤（MM）：多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞異常增生性疾病，正常漿細(xì)胞為CD38+/CD45 dim-，使用CD38/CD45雙標(biāo)記檢測(cè)外周血和骨髓標(biāo)本，可以準(zhǔn)確劃定漿細(xì)胞群。通常使用CD38和CD45，結(jié)合輕鏈檢查，對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行分析。另外，正常漿細(xì)胞的表面標(biāo)記為CD19+/CD56-，而多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞通過為CD19-/CD56+。這樣，使用流式細(xì)胞儀對(duì)外周血或骨髓標(biāo)本進(jìn)行多參數(shù)分析，并計(jì)算漿細(xì)胞含量，對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤的診斷和治療評(píng)估有重要意義。
CD34的絕對(duì)計(jì)數(shù)：造血干/祖細(xì)胞移植加強(qiáng)烈化療是治愈某些難治性疾病的有效方法；它不僅可以用于某些惡性血液病的治療，而且還可以用于其他惡性實(shí)體瘤的治療。骨髓移植（BMT）或外周血造血干細(xì)胞移植（PBSCT）的成功與否，除了與是否合并并發(fā)癥有關(guān)外，移植物中CD34+細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量是快速成功植活的重要因素。精確測(cè)定CD34對(duì)于判斷移植后的植活和選擇GCSF動(dòng)員外周血干細(xì)胞的采集時(shí)間，有著重要指導(dǎo)意義。
3 FCM在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用
流式細(xì)胞術(shù)利用實(shí)體瘤標(biāo)本或穿刺標(biāo)本、胸腹腔液體、膀胱沖洗液、尿液、食道鏡及支氣管鏡鉗取的少量活檢組織等對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA會(huì)計(jì)師測(cè)定，解析細(xì)胞周期，通過腫瘤細(xì)胞異倍體測(cè)定，鑒別良性與惡性腫瘤，預(yù)測(cè)各種癌的預(yù)后，并能在化療中對(duì)藥物的選擇，放療中強(qiáng)度、時(shí)間的決定等起主要作用［5］。根據(jù)細(xì)胞周期分析結(jié)果，適當(dāng)選用周期特異性藥物或非周期特異性藥物，可協(xié)助擬定治療方案；根據(jù)化療過程中腫瘤細(xì)胞DNA會(huì)計(jì)師分布直方圖的變化，可了解細(xì)胞動(dòng)力學(xué)變化，以此評(píng)估藥物療效。
多藥耐藥（MDR）的研究：白血病治療及腫瘤化療的失敗在很大程度上是由于白血病細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生了耐藥。因此，對(duì)白血病和腫瘤細(xì)胞耐藥機(jī)制的研究具有重要的意義。但耐藥的形成過程很多，主要有幾個(gè)方面，包括藥物吸收減少、細(xì)胞解毒作用增強(qiáng)、靶分子改變、DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)、細(xì)胞內(nèi)藥物溢出增多、細(xì)胞凋亡的抑制等。多藥耐藥基因編碼的P糖蛋白，是白血病細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞抗藥性的分子學(xué)基礎(chǔ)，也是影響化療療效的主要障礙。利用FCM檢測(cè)多藥耐藥基因，則可為藥理學(xué)研究提供依據(jù)。
參 考 文 獻(xiàn)
1左邊富流式細(xì)胞術(shù)與生物醫(yī)學(xué)［M］沈陽：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1996129~422
2單衛(wèi)民，馮萍，俞秋興流式細(xì)胞儀檢測(cè)HLAB27［J］臨床檢驗(yàn)雜志，2000，18（6），366
3Jennnings CD,Foon KARecent advances in flow cytometry;application to the diagnosis of hematologic malignancy［Ｊ］Blood,1997,90(8);2863
4韓悅，王兆鉞，朱明清，等血小板血身抗體的流式細(xì)胞儀檢測(cè)與意義［J］臨床血液學(xué)雜志，2000，13（5）:222
5沈蘭蘭，蕭樹東流式細(xì)胞儀技術(shù)在消化道腫瘤中的應(yīng)用［J］引進(jìn)國(guó)外醫(yī)藥技術(shù)與設(shè)備，1999，5（2）: 19
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