中華按蚊多態(tài)微衛(wèi)星DNA位點的篩選和特征研究

【摘要】  目的： 對中華按蚊多態(tài)的微衛(wèi)星DNA位點進行分離和篩選，并闡明其特征. 方法： 應(yīng)用中華按蚊基因組DNA的酶切片段與生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交，親合素富集和超濾離心濃縮目的片段，擴增放大，克隆并測序，構(gòu)建中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫. 在其中挑選合適的微衛(wèi)星位點，建立擴增體系. 應(yīng)用中華按蚊現(xiàn)場樣本擴增不同的微衛(wèi)星位點，聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點. 結(jié)果： 構(gòu)建的中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫中包含252條序列，GenBank注冊登記號為EF620047～EF620298. 其中，雙核苷酸重復(fù)最為常見，三核苷酸重復(fù)次之，多核苷酸重復(fù)少見；含（CA）和（GT）重復(fù)的序列最多，重復(fù)次數(shù)最多可達56次；完整序列占35.3%，非完整序列占20.2%，復(fù)合序列占18.7%，其余為非典型序列. 設(shè)計了22對引物擴增不同的微衛(wèi)星位點，其中20個位點產(chǎn)生特異的PCR產(chǎn)物，PAGE結(jié)果顯示其中15個位點具有多態(tài)性. 結(jié)論： 獲得了中華按蚊新的多態(tài)微衛(wèi)星位點共15個，為中華按蚊群體遺傳和其他相關(guān)研究提供了分子標(biāo)志. 
【關(guān)鍵詞】  中華按蚊；微衛(wèi)星DNA
    0引言
    微衛(wèi)星DNA是一類簡單的短核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列，又稱簡單重復(fù)序列，廣泛分布于真核生物的基因組中，每間隔10～50 kb即存在一個微衛(wèi)星DNA. 微衛(wèi)星DNA包括核心序列和兩側(cè)的側(cè)翼序列，通常核心序列重復(fù)單元長1～6 bp，重復(fù)次數(shù)為10～60次，其重復(fù)次數(shù)的差異導(dǎo)致微衛(wèi)星DNA具豐富的長度多態(tài)性［1-2］. 微衛(wèi)星DNA已經(jīng)廣泛應(yīng)用于研究生物多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)、行為生態(tài)和親緣關(guān)系等［3］，是一種理想的的分子標(biāo)志. 中華按蚊（Anopheles sinensis Wiedemann, 1828）在我國分布廣且種群數(shù)量大，是以往文獻記載中瘧疾和絲蟲病的重要傳播媒介［4-5］. 本研究擬構(gòu)建中華按蚊的微衛(wèi)星DNA庫并篩選其中多態(tài)的微衛(wèi)星位點，為中華按蚊基因組學(xué)研究積累基礎(chǔ)資料，并為其相關(guān)研究提供新的分子標(biāo)志.
    1材料和方法
    1.1材料構(gòu)建中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫的樣本為上海實驗室品系，由中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所提供. 現(xiàn)場中華按蚊采自云南思茅（2005?08，n=10）、云南鹽津（2006?07，n=10）和湖北武漢（2006?07，n=10），選擇雌性成蟲為實驗材料.
    1.2方法
    1.2.1微衛(wèi)星DNA庫構(gòu)建基因組DNA的抽提參照Hammond等的文獻進行［6］，-20℃保存待用. 基因組DNA經(jīng)Sau3AI酶切，回收200～800 bp的片段，加SAUL接頭連接，接頭序列如下：SAULA?：GCGGTACCCGGGAAGCTTGG，SAULB?：GATCCCAAGCTTCCGGGTACCGC. 以SAULA為引物，連接產(chǎn)物作為模板PCR擴增，反應(yīng)液中含PCR緩沖液、2.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTP，0.8 μmol/L引物，0.6 U Taq 酶（上海生工生物工程有限公司）和2 μL模板，在熱循環(huán)儀（PTC?100，美國ABI公司）上執(zhí)行如下程序：72℃ 5 min后，94℃ 1 min，67℃ 1 min和72℃ 2 min共32個循環(huán)，72℃延伸5 min. 將擴增產(chǎn)物變性后，與Biotin?16?dd UTP（瑞士Roche公司）標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交，探針包括：(AAT)17，(GA)25，(CCT)17，(AC)25，(CAG)17，(CAC)5，(TC)10，(GT)8和(TG)18. 用親和素Vectrex Avidin D（英國Vector Labs公司）捕獲并超濾離心（美國Millipore公司）濃縮富集雜交的目的片段. 以富集的核酸作為模板，SAULA為引物擴增，反應(yīng)體系和程序同前. 隨后，用PCR產(chǎn)物再次雜交、捕獲、濃縮富集和擴增. 將上述擴增產(chǎn)物插入TOPO?T載體（美國Invitrogene公司），轉(zhuǎn)化E.coli JM109，挑選含微衛(wèi)星DNA序列的陽性克隆，用四色熒光標(biāo)記雙脫氧鏈終止法測序（PE?ABI3770全自動測序儀，上海英駿生物技術(shù)有限公司），應(yīng)用BioEdit（Version 5.0.9）軟件包分析所獲序列.
    1.2.2微衛(wèi)星DNA多態(tài)位點篩選單蚊抽提現(xiàn)場中華按蚊基因組DNA，參照文獻進行分子鑒別確認(rèn)蚊種為中華按蚊［7］. 選擇22條重復(fù)次數(shù)較多，且典型的微衛(wèi)星DNA序列，應(yīng)用Primer 3（Version 3.1）軟件包設(shè)計引物. 以單蚊基因組DNA為模板，PCR擴增微衛(wèi)星DNA（反應(yīng)體系和程序同前），退火溫度范圍在55℃～60℃. 擴增產(chǎn)物經(jīng)5%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，銀染、顯色，依據(jù)凝膠上的條帶判斷其是否具有多態(tài)性.
    2結(jié)果
    2.1中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫構(gòu)建的中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫中包含282條序列，其中18條序列完全相同，21條序列較短（小于100 bp），故有效的微衛(wèi)星DNA序列共252條，GenBank注冊號為EF620047～EF620298. 分析所獲的微衛(wèi)星DNA序列，顯示其長度范圍為50～800 bp，大多數(shù)在300 bp左右. 就重復(fù)情形而言，雙核苷酸重復(fù)最為常見，三核苷酸重復(fù)次之，多核苷酸重復(fù)少見；含（CA）和（GT）重復(fù)的序列最多，重復(fù)次數(shù)不等，最多可達56次. 所獲的微衛(wèi)星DNA依據(jù)文獻［8］標(biāo)準(zhǔn)劃分，結(jié)果完整序列為89條（35.3%），非完整序列51條（20.2%），復(fù)合序列47條（18.7%），其余為非典型序列（25.8%）.
    2.2中華按蚊微衛(wèi)星多態(tài)位點設(shè)計并合成了22對擴增微衛(wèi)星DNA的引物，對現(xiàn)場樣本進行擴增的結(jié)果顯示，20個位點有特異的PCR產(chǎn)物，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（一條帶為純合子，兩條帶以上為雜合子），共有15個微衛(wèi)星DNA位點具有多態(tài)性（表1）. 本研究的多態(tài)微衛(wèi)星位點在退火溫度為55℃時，均存在特異產(chǎn)物.  表1中華按蚊多態(tài)的15個微衛(wèi)星位點特征
    3討論
    通過比較分析本研究所獲中華按蚊微衛(wèi)星DNA序列的特點，發(fā)現(xiàn)與已報告的岡比亞按蚊（An. gambiae）［9-10］，催命按蚊（An. funestus）［11-12］和穆歇按蚊（An. moucheti）［13］等相似，均為雙核苷酸重復(fù)最常見，三核苷酸重復(fù)次之，多核苷酸重復(fù)少見. 韓國學(xué)者Jung等［14］應(yīng)用(GA)22和(CA)22寡核苷酸探針分離和篩選了韓國的中華按蚊微衛(wèi)星DNA陽性克隆48個，與之比較，本研究應(yīng)用了更多的探針，特別是三堿基重復(fù)序列的探針，分離的我國中華按蚊微衛(wèi)星DNA序列，不僅重復(fù)單元序列多樣化，而且序列的數(shù)量也較多，更具廣泛性，極大地豐富了中華按蚊的微衛(wèi)星DNA序列數(shù)據(jù)庫.

   通常一個理想的微衛(wèi)星DNA標(biāo)志應(yīng)具備完整的重復(fù)序列，有相當(dāng)長度的側(cè)翼區(qū)（至少15 bp）以適合引物設(shè)計的需要. 本研究分離的中華按蚊微衛(wèi)星DNA序列中，絕大部分的側(cè)翼區(qū)有足夠的長度可供引物設(shè)計. 筆者在檢測的22個微衛(wèi)星位點中，獲得了15個具有多態(tài)性，提示中華按蚊微衛(wèi)星位點的多態(tài)性比例較高，為68.2%（15/20），結(jié)果與文獻報告的相似，如：韓國的中華按蚊為64.7%(11/17)［14］，催命按蚊為57.4%（27/47）［11］和環(huán)跗庫蚊（Culex tarsalis）為60.0%(12/20) ［15］.
    本研究中華按蚊的多態(tài)微衛(wèi)星位點中等位基因數(shù)從2到12不等（未發(fā)表資料）也與文獻報告的相當(dāng)［11, 14-15］，篩選得到的中華按蚊多態(tài)微衛(wèi)星位點與韓國學(xué)者報告的多態(tài)位點無重復(fù)性［14］，均為首次報道.
    致謝承蒙湖北省疾病預(yù)防控制中心黃光全、云南省寄生蟲病防治所顧云安和第二軍醫(yī)大學(xué)楊曼尼協(xié)助采集現(xiàn)場標(biāo)本，在此一并表示感謝.
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