中華按蚊多態(tài)微衛(wèi)星DNA位點的篩選和特征研究
【摘要】 目的: 對中華按蚊多態(tài)的微衛(wèi)星DNA位點進行分離和篩選,并闡明其特征. 方法: 應(yīng)用中華按蚊基因組DNA的酶切片段與生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交,親合素富集和超濾離心濃縮目的片段,擴增放大,克隆并測序,構(gòu)建中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫. 在其中挑選合適的微衛(wèi)星位點,建立擴增體系. 應(yīng)用中華按蚊現(xiàn)場樣本擴增不同的微衛(wèi)星位點,聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點. 結(jié)果: 構(gòu)建的中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫中包含252條序列,GenBank注冊登記號為EF620047~EF620298. 其中,雙核苷酸重復(fù)最為常見,三核苷酸重復(fù)次之,多核苷酸重復(fù)少見;含(CA)和(GT)重復(fù)的序列最多,重復(fù)次數(shù)最多可達56次;完整序列占35.3%,非完整序列占20.2%,復(fù)合序列占18.7%,其余為非典型序列. 設(shè)計了22對引物擴增不同的微衛(wèi)星位點,其中20個位點產(chǎn)生特異的PCR產(chǎn)物,PAGE結(jié)果顯示其中15個位點具有多態(tài)性. 結(jié)論: 獲得了中華按蚊新的多態(tài)微衛(wèi)星位點共15個,為中華按蚊群體遺傳和其他相關(guān)研究提供了分子標(biāo)志.
【關(guān)鍵詞】 中華按蚊;微衛(wèi)星DNA
0引言
微衛(wèi)星DNA是一類簡單的短核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列,又稱簡單重復(fù)序列,廣泛分布于真核生物的基因組中,每間隔10~50 kb即存在一個微衛(wèi)星DNA. 微衛(wèi)星DNA包括核心序列和兩側(cè)的側(cè)翼序列,通常核心序列重復(fù)單元長1~6 bp,重復(fù)次數(shù)為10~60次,其重復(fù)次數(shù)的差異導(dǎo)致微衛(wèi)星DNA具豐富的長度多態(tài)性[1-2]. 微衛(wèi)星DNA已經(jīng)廣泛應(yīng)用于研究生物多樣性、群體遺傳結(jié)構(gòu)、行為生態(tài)和親緣關(guān)系等[3],是一種理想的的分子標(biāo)志. 中華按蚊(Anopheles sinensis Wiedemann, 1828)在我國分布廣且種群數(shù)量大,是以往文獻記載中瘧疾和絲蟲病的重要傳播媒介[4-5]. 本研究擬構(gòu)建中華按蚊的微衛(wèi)星DNA庫并篩選其中多態(tài)的微衛(wèi)星位點,為中華按蚊基因組學(xué)研究積累基礎(chǔ)資料,并為其相關(guān)研究提供新的分子標(biāo)志.
1材料和方法
1.1材料構(gòu)建中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫的樣本為上海實驗室品系,由中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所提供. 現(xiàn)場中華按蚊采自云南思茅(2005?08,n=10)、云南鹽津(2006?07,n=10)和湖北武漢(2006?07,n=10),選擇雌性成蟲為實驗材料.
1.2方法
1.2.1微衛(wèi)星DNA庫構(gòu)建基因組DNA的抽提參照Hammond等的文獻進行[6],-20℃保存待用. 基因組DNA經(jīng)Sau3AI酶切,回收200~800 bp的片段,加SAUL接頭連接,接頭序列如下:SAULA?:GCGGTACCCGGGAAGCTTGG,SAULB?:GATCCCAAGCTTCCGGGTACCGC. 以SAULA為引物,連接產(chǎn)物作為模板PCR擴增,反應(yīng)液中含PCR緩沖液、2.5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP,0.8 μmol/L引物,0.6 U Taq 酶(上海生工生物工程有限公司)和2 μL模板,在熱循環(huán)儀(PTC?100,美國ABI公司)上執(zhí)行如下程序:72℃ 5 min后,94℃ 1 min,67℃ 1 min和72℃ 2 min共32個循環(huán),72℃延伸5 min. 將擴增產(chǎn)物變性后,與Biotin?16?dd UTP(瑞士Roche公司)標(biāo)記的寡核苷酸探針雜交,探針包括:(AAT)17,(GA)25,(CCT)17,(AC)25,(CAG)17,(CAC)5,(TC)10,(GT)8和(TG)18. 用親和素Vectrex Avidin D(英國Vector Labs公司)捕獲并超濾離心(美國Millipore公司)濃縮富集雜交的目的片段. 以富集的核酸作為模板,SAULA為引物擴增,反應(yīng)體系和程序同前. 隨后,用PCR產(chǎn)物再次雜交、捕獲、濃縮富集和擴增. 將上述擴增產(chǎn)物插入TOPO?T載體(美國Invitrogene公司),轉(zhuǎn)化E.coli JM109,挑選含微衛(wèi)星DNA序列的陽性克隆,用四色熒光標(biāo)記雙脫氧鏈終止法測序(PE?ABI3770全自動測序儀,上海英駿生物技術(shù)有限公司),應(yīng)用BioEdit(Version 5.0.9)軟件包分析所獲序列.
1.2.2微衛(wèi)星DNA多態(tài)位點篩選單蚊抽提現(xiàn)場中華按蚊基因組DNA,參照文獻進行分子鑒別確認(rèn)蚊種為中華按蚊[7]. 選擇22條重復(fù)次數(shù)較多,且典型的微衛(wèi)星DNA序列,應(yīng)用Primer 3(Version 3.1)軟件包設(shè)計引物. 以單蚊基因組DNA為模板,PCR擴增微衛(wèi)星DNA(反應(yīng)體系和程序同前),退火溫度范圍在55℃~60℃. 擴增產(chǎn)物經(jīng)5%聚丙烯酰胺凝膠電泳后,銀染、顯色,依據(jù)凝膠上的條帶判斷其是否具有多態(tài)性.
2結(jié)果
2.1中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫構(gòu)建的中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫中包含282條序列,其中18條序列完全相同,21條序列較短(小于100 bp),故有效的微衛(wèi)星DNA序列共252條,GenBank注冊號為EF620047~EF620298. 分析所獲的微衛(wèi)星DNA序列,顯示其長度范圍為50~800 bp,大多數(shù)在300 bp左右. 就重復(fù)情形而言,雙核苷酸重復(fù)最為常見,三核苷酸重復(fù)次之,多核苷酸重復(fù)少見;含(CA)和(GT)重復(fù)的序列最多,重復(fù)次數(shù)不等,最多可達56次. 所獲的微衛(wèi)星DNA依據(jù)文獻[8]標(biāo)準(zhǔn)劃分,結(jié)果完整序列為89條(35.3%),非完整序列51條(20.2%),復(fù)合序列47條(18.7%),其余為非典型序列(25.8%).
2.2中華按蚊微衛(wèi)星多態(tài)位點設(shè)計并合成了22對擴增微衛(wèi)星DNA的引物,對現(xiàn)場樣本進行擴增的結(jié)果顯示,20個位點有特異的PCR產(chǎn)物,經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析(一條帶為純合子,兩條帶以上為雜合子),共有15個微衛(wèi)星DNA位點具有多態(tài)性(表1). 本研究的多態(tài)微衛(wèi)星位點在退火溫度為55℃時,均存在特異產(chǎn)物. 表1中華按蚊多態(tài)的15個微衛(wèi)星位點特征
3討論
通過比較分析本研究所獲中華按蚊微衛(wèi)星DNA序列的特點,發(fā)現(xiàn)與已報告的岡比亞按蚊(An. gambiae)[9-10],催命按蚊(An. funestus)[11-12]和穆歇按蚊(An. moucheti)[13]等相似,均為雙核苷酸重復(fù)最常見,三核苷酸重復(fù)次之,多核苷酸重復(fù)少見. 韓國學(xué)者Jung等[14]應(yīng)用(GA)22和(CA)22寡核苷酸探針分離和篩選了韓國的中華按蚊微衛(wèi)星DNA陽性克隆48個,與之比較,本研究應(yīng)用了更多的探針,特別是三堿基重復(fù)序列的探針,分離的我國中華按蚊微衛(wèi)星DNA序列,不僅重復(fù)單元序列多樣化,而且序列的數(shù)量也較多,更具廣泛性,極大地豐富了中華按蚊的微衛(wèi)星DNA序列數(shù)據(jù)庫.
本研究中華按蚊的多態(tài)微衛(wèi)星位點中等位基因數(shù)從2到12不等(未發(fā)表資料)也與文獻報告的相當(dāng)[11, 14-15],篩選得到的中華按蚊多態(tài)微衛(wèi)星位點與韓國學(xué)者報告的多態(tài)位點無重復(fù)性[14],均為首次報道.
致謝承蒙湖北省疾病預(yù)防控制中心黃光全、云南省寄生蟲病防治所顧云安和第二軍醫(yī)大學(xué)楊曼尼協(xié)助采集現(xiàn)場標(biāo)本,在此一并表示感謝.
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