硝酸甘油減輕對乙酰氨基酚肝毒性的作用與機(jī)制

                                    作者：任利君 彌曼 寧養(yǎng)紅 李汾 李新華

【摘要】  目的: 研究硝酸甘油(GTN)對對乙酰氨基酚（AP）肝毒性的影響與機(jī)制. 方法： 小鼠ip GTN 0.1~1.6 mg/kg，15 min后ip AP 300 mg/kg，6 h后測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)；GTN（1.6 mg/kg）預(yù)處理小鼠，測定AP半數(shù)致死量（LD50）；熒光法測定肝蛋白S?亞硝基化水平；分光光度法測定肝谷氨酸脫氫酶(GDH)活性；S?亞硝基谷胱甘肽（GSNO）處理GDH純酶，Saville?Griess法測定其S?亞硝基化水平，并觀察對N?乙酰?p?苯醌亞胺（NAPQI）滅活GDH效應(yīng)的影響. 結(jié)果： GTN降低AP導(dǎo)致的ALT，AST升高，使AP對小鼠LD50由321 mg/kg上升至762 mg/kg；GTN引起肝蛋白S?亞硝基化水平升高，使AP對肝GDH的抑制作用完全消失；GSNO誘發(fā)GDH純酶發(fā)生S?亞硝基化，且不影響酶活性，但修飾后的GDH不被NAPQI滅活. 結(jié)論： GTN可減輕AP肝毒性，其機(jī)制與誘發(fā)肝蛋白巰基S?亞硝基化，減少NAPQI與蛋白（如GDH）巰基的共價(jià)結(jié)合有關(guān). 
【關(guān)鍵詞】  對乙酰氨基酚；硝酸甘油；S?亞硝基化；谷氨酸脫氫酶；肝毒性；肝/藥物作用
   0引言
    對乙酰氨基酚(acetaminophen, AP)過量致肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞向心性壞死是西方國家急性肝功能衰竭的首要病因［1］．目前認(rèn)為，過量AP經(jīng)肝P450酶系代謝活化，產(chǎn)生N?乙酰?p?苯醌亞胺［N?acetyl?p?benzoquinone imine,(NAPQI)］，后者迅速與還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）的巰基結(jié)合，使其耗竭后進(jìn)而與蛋白巰基結(jié)合，破壞蛋白功能而引發(fā)毒性. 補(bǔ)充GSH是較為滿意的防治措施［1］. 本研究選用硝酸甘油（glyceryl trinitrate，GTN)誘導(dǎo)肝蛋白巰基發(fā)生S?亞硝基化修飾［2］，以保護(hù)蛋白巰基，減少或避免NAPQI攻擊，觀察是否可減輕AP肝毒性.
    1材料和方法
    1.1材料AP，NAPQI，2,3?二氨基萘（2,3?diaminonaphthalene, DAN），Griess試劑，牛肝谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase, GDH)(美國Sigma公司)；5?磺基水楊酸（5?sulfosalicylic acid，SSA），GSH，氯化汞（HgCl2），亞硝酸鈉(美國Amresco公司)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性測定試劑盒（寧波亞太生物技術(shù)有限公司）；GTN注射液（山東華信制藥有限公司）；超濾管（美國Millipore公司）；預(yù)裝脫鹽柱，熒光分光光度計(jì)，紫外分光光度計(jì)(美國Bio?rad公司)．雄性昆明小鼠，體質(zhì)量18~20 g，由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.
    1.2方法
    1.2.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案實(shí)驗(yàn)一:80只小鼠，禁食不禁水10 h，隨機(jī)分為8組，每組10只，分別ip給藥：GTN(0.1, 0.4, 1.6 mg/kg)，AP(300 mg/kg)，GTN+AP（先注射GTN，15 min 后注射AP），對照組ip等體積生理鹽水. 給藥后6 h摘眼球取血，制備血清，按照試劑盒說明書測定ALT和AST活性；同時(shí)取肝臟，稱質(zhì)量后剪碎，以5倍體積50 mmol/L磷酸緩沖液(pH=7.4)勻漿，1000 g離心10 min，保留上清，取100 μL 測定GDH催化活性，其余樣品脫鹽后測定蛋白S?亞硝基化水平. 實(shí)驗(yàn)二：測定LD50，采用140只小鼠，隨機(jī)分為14組，每組10只，禁食15 h，其中7組ip GTN 1.6 mg/kg，另7組ip等體積生理鹽水，15 min后均ip AP：生理鹽水組AP劑量分別為800，571，408，292，208，149，106 mg/kg，GTN預(yù)處理組AP劑量分別為1500，1071，765，547，390，279，199 mg/kg；AP加熱至50℃溶解，給藥容積為15 mL/kg；觀察給藥后24 h內(nèi)各組小鼠死亡率，計(jì)算LD50.
    1.2.2GDH催化活性測定按照文獻(xiàn)［3］進(jìn)行.
    1.2.3熒光法測定肝蛋白S?亞硝基化水平蛋白濃度調(diào)整為5 g/L，取1 mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣品等分為二，一份加入HgCl2分解S?亞硝基化蛋白，釋放一氧化氮（nitric oxide, NO）與DAN（溶解于0.62 mol/L HCl）反應(yīng)，生成熒光物質(zhì)，另一份加入HgCl2的溶劑作為對照，樣品調(diào)pH為中性后加SSA沉淀蛋白，離心取上清，測定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長380 nm，吸收波長450 nm，以亞硝酸鈉做標(biāo)準(zhǔn)曲線，折算蛋白S?亞硝基化水平［4］.
    1.2.4S?亞硝基谷胱甘肽（S?nitrosoglutathione，GSNO）的合成與定量200 mmol/L亞硝酸鈉與200 mmol/L GSH（均溶解于0.5 mol/L HCL）等體積混合，室溫避光反應(yīng)5 min，得紅色產(chǎn)物，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至中性，以消光系數(shù)定量［5］.
    1.2.5GDH與GSNO及NAPQI反應(yīng)GDH透析除去硫酸銨，蛋白濃度調(diào)整為1 g/L，取1 mL與等體積GSNO（終濃度0，20，200，2000 μmol/L）室溫避光反應(yīng)30 min，采用脫鹽柱去除過量GSNO，一半樣品用于測定GDH催化活性，并以Saville?Griess法測定酶蛋白S?亞硝基化水平［6］，剩余樣品調(diào)整蛋白濃度為0.25 g/L，取1 mL加入NAPQI 1 μL，使其終濃度為10, 30, 90 μmol/L， 室溫反應(yīng)30 min，利用超濾管進(jìn)行脫鹽濃縮，測定GDH催化活性與S?亞硝基化水平［6］；上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次.
    統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以x±s表示，用SPSS 13．0軟件包進(jìn)行方差分析(ANOVA)，多重比較采用LSD?t檢驗(yàn)法，組間方差不齊時(shí)，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)法，采用Bliss法計(jì)算LD50.
    2結(jié)果
    2.1GTN改善AP導(dǎo)致的血清生化指標(biāo)改變小鼠單獨(dú)注射AP 300 mg/kg，血清ALT和AST較對照組均升高（P<0.05）；單獨(dú)注射GTN，各劑量組均不影響ALT和AST活性；GTN與AP合用，血清AST和ALT較單用AP降低（P<0.05），但與對照組比較，ALT和AST仍偏高（P<0.05，表1）. 在GTN劑量方面，預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GTN劑量達(dá)到50 mg/kg時(shí)，小鼠全部死亡；劑量小于0.05 mg/kg時(shí)，保護(hù)作用幾乎消失；劑量大于2.0 mg/kg 時(shí), 保護(hù)作用逐漸減弱.  表1硝酸甘油和對乙酰氨基酚對小鼠血清生化指標(biāo)的影響
    2.2GTN成倍提高AP的LD50選用GTN保護(hù)作用最強(qiáng)的劑量1.6 mg/kg，測定預(yù)處理對AP LD50的影響，發(fā)現(xiàn)單用AP對小鼠的LD50為321 mg/kg，95%可信限為(262～394）mg/kg，而GTN預(yù)處理后，AP的LD50升高至762 mg/kg，95%可信限為(618～969）mg/kg.
    2.3GTN對肝蛋白S?亞硝基化水平和GDH酶活性的影響正常小鼠肝臟（對照組）存在一定量的S?亞硝基化修飾蛋白，AP處理后其水平未見統(tǒng)計(jì)學(xué)變化，而GTN預(yù)處理使其較對照組升高（P<0.05），GTN與AP合用組S?亞硝基化水平也高于對照組（P<0.05）；單獨(dú)AP給藥使肝組織GDH催化活性明顯降低（P<0.05），單獨(dú)注射GTN對GDH催化活性沒有明顯影響，而GTN與AP合用時(shí)，GDH催化活性較單用AP升高（P<0.05，表2）. 表2硝酸甘油和對乙酰氨基酚對肝蛋白S?亞硝基化水平及GDH活性的影響(
    2.4GSNO誘導(dǎo)GDH純酶發(fā)生S?亞硝基化并保護(hù)其不被NAPQI滅活GDH純酶與生理鹽水（對照）體外孵育，用Saville?Griess法檢測不到S亞硝基化修飾， 與GSNO孵育反應(yīng)后，GDH發(fā)生了S?亞硝基化修飾，但該修飾并不影響酶催化活性；AP代謝產(chǎn)物NAPQI明顯抑制GDH純酶的催化活性(P<0.05)；而GSNO(200 μmol/L)預(yù)處理可完全對抗NAPQI的抑制作用（表3）. 表3GSNO和NAPQI對GDH純酶的修飾及功能影響    3討論
    本研究表明，GTN可減輕AP肝毒性，這對臨床合理、安全用藥具有一定地指導(dǎo)意義. AP是應(yīng)用廣泛的解熱鎮(zhèn)痛藥，多種抗感冒復(fù)方制劑均含有AP，服用這類藥物具有潛在的肝毒性. 本研究結(jié)果提示，同時(shí)服用GTN可望降低該風(fēng)險(xiǎn)；短期服用GTN幾乎沒有副作用，因而二者合用不會(huì)增加新的不良反應(yīng)；尤其對于經(jīng)常服用GTN的心血管病患者，提醒其服用GTN后再服用含AP的各種制劑，可能會(huì)對患者有所裨益. 必需指出，本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果尚不能直接外推到臨床用藥，但可為相關(guān)臨床試驗(yàn)提供一定理論依據(jù).
    AP肝毒性的機(jī)制主要與蛋白巰基被破壞有關(guān)，例如GDH的巰基可與NAPQI結(jié)合而導(dǎo)致酶活性降低［7］. 本研究發(fā)現(xiàn)，一氧化氮供體GSNO在體外可誘導(dǎo)GDH發(fā)生巰基S?亞硝基化，防止其被NAPQI滅活，同時(shí)GTN也可防止GDH在體內(nèi)被AP滅活，提示GTN降低AP肝毒性的作用機(jī)制與誘發(fā)肝蛋白發(fā)生巰基S?亞硝基化，保護(hù)巰基以維持蛋白正常功能有關(guān).
    GTN減輕 AP肝毒的作用與機(jī)制，可望揭示一種全新的肝細(xì)胞保護(hù)機(jī)制. 文獻(xiàn)報(bào)道，肝組織靶向性的外源NO供體以及內(nèi)源性過量產(chǎn)生的NO，均可減輕AP肝毒性，但其作用機(jī)制尚未完全明確，本研究提示NO可能通過增加蛋白S?亞硝基化、減少NAPQI共價(jià)結(jié)合而發(fā)揮護(hù)肝作用. 另外，在半乳糖胺誘發(fā)的肝細(xì)胞損傷過程中，伴隨有顯著的蛋白S?亞硝基化升高［8］，但其生物意義不明確，本研究提示，這種應(yīng)激性的S?亞硝基化升高，可能是機(jī)體的一種自發(fā)保護(hù)機(jī)制.
    本研究結(jié)果顯示GDH是一個(gè)全新的S?亞硝基化蛋白靶點(diǎn)，但該修飾并不影響其催化活性. 此前報(bào)道的諸多蛋白靶點(diǎn)，均可通過S?亞硝基化修飾而調(diào)控功能改變［9］，而不影響功能的修飾往往被忽視，迄今尚未見任何文獻(xiàn)報(bào)道. 本研究表明，不影響蛋白功能的S?亞硝基化同樣具有重要生物學(xué)意義，可保護(hù)巰基，使其不受有毒活性物質(zhì)攻擊，維持蛋白在應(yīng)激狀態(tài)下的正常功能，這對S?亞硝基化研究領(lǐng)域提供了新的思路.
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