布氏鏡檢查丁酸鈉影響HT

                                    作者：劉成霞 張尚忠 劉宗印 黃麗華 張孝衛(wèi)

【關(guān)鍵詞】  多功能透射顯微鏡(布氏鏡)；丁酸鈉；HT
　　【摘要】  目的  觀察丁酸鈉對(duì)結(jié)腸癌HT２９細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)特性的影響。方法  多功能透射顯微鏡(布氏鏡)動(dòng)態(tài)觀察丁酸鈉作用前后HT２９細(xì)胞的生長狀態(tài)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及貼壁過程的變化。結(jié)果  丁酸鈉5 mmol/L作用24 h后，HT２９細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞巢變小，巢內(nèi)細(xì)胞數(shù)減少；細(xì)胞變成圓形 ，細(xì)胞大小趨于一致；細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)呈塊狀聚集，折光性降低，呈現(xiàn)出凋亡細(xì)胞形態(tài)；貼壁過程明顯變緩。結(jié)論  丁酸鈉可以改變HT２９的生長狀態(tài)，抑制其生長；布氏鏡可以動(dòng)態(tài)地觀察藥物作用前后培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)、微細(xì)結(jié)構(gòu)及運(yùn)動(dòng)的變化，是一項(xiàng)先進(jìn)的、具有實(shí)用價(jià)值的檢查技術(shù)。
　　【關(guān)鍵詞】  多功能透射顯微鏡(布氏鏡)；丁酸鈉；HT２９細(xì)胞株
　　【Ａbstract】  Ｏbjective  To investigate the effect of sodium butyrate on the appearance and  bionomics of colon cancer line HT２９．Ｍethods  Viewing the effect of sodium butyrate on differences of the growth,as well as the cell movement,and the adherence procedure of HT２９ with bradford variable projective microscopy (BVPM).Ｒesults  Ａfter 24 hours of coincubation of HT２９　and sodium butyrate (5mmol/L),it was showed that the amount of HT２９ decreased,the cell nests shrank,and the cell population of each cell nest diminished;most of the HT29 changed into  globular,and the bulk of HT２９ looked welldistibuted;chromatin gathered uneven,and the refraction weaken,many of them looked as apoptosis cells;adherence procedure of HT２９ stepped down obviously.Ｃonclusion  Sodium butyrate may inhibit HT２９ growth  and monitoring the changes of cultured cells in cytomorph，fine structure and its movement consecutively with BVPM is an advanced and practical examination technique.
　　【Ｋey　words】  braford  variable projective microscopy (BVPM), sodium butyrate,ＨＴ２９ cell line
　　對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，同時(shí)給予藥物干預(yù)是目前研究和篩選抗腫瘤藥物的主要方法之一。但關(guān)于藥物對(duì)培養(yǎng)的活體腫瘤細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化研究尚未見報(bào)道。本研究應(yīng)用布氏鏡對(duì)丁酸鈉作用前后HT２９細(xì)胞形態(tài)和微細(xì)結(jié)構(gòu)的變化進(jìn)行動(dòng)態(tài)圖像掃描與分析，清晰地觀察到HT２９細(xì)胞形態(tài)學(xué)和生物學(xué)行為的動(dòng)態(tài)變化和丁酸鈉對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。
　　1  材料和方法
　　1．１  布氏鏡(bradford variable projective microscopy,BVPM,可變投射顯微鏡的簡(jiǎn)稱)BVPM１５型，美國生物公司生產(chǎn)。
　�。保�２  細(xì)胞株  結(jié)腸癌HT２９細(xì)胞株，購自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院。
　　１．３  藥物和標(biāo)本制備
　　1．３．１  丁酸鈉(Sodium Butyrate):購于Sigma公司，用PBS配制成01 mol/L的儲(chǔ)存液，4 ℃保存?zhèn)溆�。臨用前用培養(yǎng)液稀釋成實(shí)驗(yàn)所需濃度。
　　132  細(xì)胞培養(yǎng)方法和標(biāo)本制備：將15 mm×15 mm大小的蓋玻片經(jīng)常規(guī)泡酸、清洗、高壓消毒處理后備用。結(jié)腸癌HT２９細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清(杭州四季青生物制品公司)的RPMI1640(Hyclone),在37℃、5%的CO２、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，用025%的胰蛋白酶消化，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×１０４／ml。將細(xì)胞接種到預(yù)先放置蓋玻片的培養(yǎng)皿中，每孔接種6 ml。置37 ℃、5%CO２恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，待細(xì)胞接近長成單層，更換培養(yǎng)液，加入丁酸鈉，使終濃度為5 mmol/L，對(duì)照組加入等量的PBS。經(jīng)丁酸鈉作用24 h后，終止培養(yǎng)。取出蓋玻片，布氏鏡觀察。
　　2  結(jié)果
　　2．１  丁酸鈉對(duì)HT２９細(xì)胞生長狀態(tài)的影響  常規(guī)培養(yǎng)24 h觀察，處于對(duì)數(shù)生長期的HT２９細(xì)胞呈巢狀生長，巢內(nèi)細(xì)胞密集，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞界限不清。細(xì)胞巢較大，多見80～１００個(gè)細(xì)胞組成的大細(xì)胞巢。巢內(nèi)細(xì)胞呈梭形或長圓形，細(xì)胞大小懸殊，可見處于不同分裂期的細(xì)胞及雙核、多核細(xì)胞，細(xì)胞表現(xiàn)出活躍的生物學(xué)狀態(tài)。丁酸鈉5 mmol/L作用24 h后觀察，細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞巢變小，巢內(nèi)細(xì)胞數(shù)多在20～４０，巢內(nèi)細(xì)胞松散，單個(gè)細(xì)胞界限清楚。視野內(nèi)幾乎見不到梭形細(xì)胞，細(xì)胞變成圓形，細(xì)胞大小趨于一致。
　�。玻�２  丁酸鈉對(duì)HT２９細(xì)胞形態(tài)的影響  正常培養(yǎng)24 h觀察，處于對(duì)數(shù)生長期的HT２９細(xì)胞核大，核漿比例可達(dá)1∶１，部分細(xì)胞表現(xiàn)為核漿比例倒置。細(xì)胞核形狀、大小不一，核仁清晰，核內(nèi)染色質(zhì)豐富，積聚于核膜周圍。丁酸鈉5 mmol/L作用24 h后觀察，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)呈塊狀聚集，折光性降低，呈現(xiàn)出凋亡細(xì)胞形態(tài)。正常培養(yǎng)的HT２９細(xì)胞膜表現(xiàn)為明顯的不規(guī)則性，細(xì)胞呈不定形。每個(gè)細(xì)胞可見20～３０個(gè)胞質(zhì)突起，呈指狀、球狀或不規(guī)則形，可見偽足的形成及迅速變形，形態(tài)多樣、多變。丁酸鈉5 mmol/L作用24 h后動(dòng)態(tài)觀察，每個(gè)細(xì)胞可見3~５個(gè)球狀突起，變化緩慢。
　�。玻�３  丁酸鈉對(duì)HT２９細(xì)胞貼壁運(yùn)動(dòng)的影響  取經(jīng)胰酶消化的正常HT２９單細(xì)胞懸液，滴于載玻片上，再加蓋玻片后立即觀察。腫瘤細(xì)胞在貼壁生長的過程中胞漿豐富，呈流動(dòng)性，細(xì)胞原生質(zhì)伸展和收縮，使細(xì)胞伸出偽足，細(xì)胞變形，以阿米巴樣運(yùn)動(dòng)完成貼壁過后繼續(xù)生長。布氏鏡6000倍間隔1 min連續(xù)記錄下的HT２９細(xì)胞的貼壁過程，可見細(xì)胞貼壁迅速。丁酸鈉5 mmol/L作用24 h后，觀察HT２９細(xì)胞的胞漿流動(dòng)性減慢，偽足、突起較少，貼壁過程明顯變緩。

3  討論
　　腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性與腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)。細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，首先是伸出胞質(zhì)突，胞漿隨之進(jìn)入胞質(zhì)突，形成阿米巴樣運(yùn)動(dòng)。在體內(nèi)，當(dāng)腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶后，必須借助本身的阿米巴樣運(yùn)動(dòng)侵入細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而侵入繼發(fā)部位形成轉(zhuǎn)移瘤，完成體內(nèi)侵襲和轉(zhuǎn)移的過程。體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移與腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性增強(qiáng)有關(guān)［１］。而體外培養(yǎng)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)則表現(xiàn)在細(xì)胞貼壁和生長過程中，細(xì)胞膜的迅速變化，細(xì)胞漿的快速流動(dòng)預(yù)示著細(xì)胞的生長代謝活躍。
　　丁酸鈉是一種組蛋白去乙�；�酶抑制劑，它通過抑制組蛋白去乙�；�酶的活性，誘導(dǎo)腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞的生長。由于其具有毒性小、抗腫瘤作用好的特點(diǎn)，近年來被廣泛用于白血病、胃癌、大腸癌、前列腺癌、乳腺癌和頭頸部腫瘤的研究［２~５］。本研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉可以抑制HT29細(xì)胞的運(yùn)輸能力，減弱其胞漿流動(dòng)，從而抑制HT29的貼壁過程，丁酸鈉作用后，HT２９細(xì)胞形態(tài)變圓，細(xì)胞膜突起變少，細(xì)胞異型性減輕，細(xì)胞分裂減慢，明顯影響細(xì)胞的生長狀態(tài)。另外，由于用藥前細(xì)胞分裂活躍，處于分裂期的大細(xì)胞較多，細(xì)胞大小懸殊，導(dǎo)致細(xì)胞平均體積較大。丁酸鈉作用后，細(xì)胞大小趨于一致，細(xì)胞平均體積較用藥前減少約1／３，與李春蕊等［6］研究結(jié)果一致�？紤]可能與丁酸鈉誘導(dǎo)p21WAF1等細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)有關(guān)。但李豐等［7］在普通光鏡下觀察了丁酸鈉對(duì)低分化人結(jié)腸癌Clone2A細(xì)胞形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)2 mmol/L丁酸鈉處理4 d后，細(xì)胞變長，并伸出較長的突起，趨向于成纖維細(xì)胞形態(tài)變化。為何不同細(xì)胞對(duì)丁酸鈉表現(xiàn)不同的反應(yīng)，機(jī)制不清，推測(cè)不同細(xì)胞株對(duì)藥物的敏感性不同，也可能與丁酸鈉的濃度和作用時(shí)間有關(guān)。
　　觀察藥物作用前后腫瘤細(xì)胞的變化是體外評(píng)價(jià)藥物抗癌效果的重要指標(biāo)。普通光學(xué)顯微鏡只能觀察固定在載玻片上的細(xì)胞，不能進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察；倒置顯微鏡盡管可以觀察到培養(yǎng)細(xì)胞的生長狀態(tài)，但因其放大倍數(shù)有限(一般放大倍數(shù)為40～４００倍)，不能清楚的觀察活細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。電子顯微鏡在觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)方面具有其他顯微鏡無可比擬的優(yōu)勢(shì)，但不能對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行觀察，且標(biāo)本制作費(fèi)時(shí)、復(fù)雜。布氏鏡具有40～１６ ００0倍的連續(xù)調(diào)節(jié)功能，同時(shí)具備相差、暗視野、微分干涉分析、中密度及偏振光等多種功能，應(yīng)用布氏鏡對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)圖像掃描，能清晰、直觀地觀察到活細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化。通過丁酸鈉作用前后HT29細(xì)胞的變化，可以更直觀地觀察丁酸鈉對(duì)HT２９細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。檢查只需將細(xì)胞培養(yǎng)在蓋玻片上，或?qū)⒓?xì)胞懸液直接滴于載玻片上直接觀察，無需固定、染色等處理，方法簡(jiǎn)便，圖像直觀。
　　本研究發(fā)現(xiàn)，HT２９呈巢狀生長，細(xì)胞分裂旺盛、運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)、貼壁過程迅速，呈現(xiàn)十分活躍的生物學(xué)特性；丁酸鈉可以改變HT２９的生長狀態(tài)，抑制其生長；布氏鏡可以動(dòng)態(tài)地觀察藥物作用前后細(xì)胞形態(tài)、微細(xì)結(jié)構(gòu)及運(yùn)動(dòng)的變化，是一項(xiàng)先進(jìn)的、具有實(shí)用價(jià)值的檢查技術(shù)。
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