淋巴管標記方法及標志物的探討
【摘要】 目的 探討不同標記方法及標志物在淋巴管檢測中的價值，為研究腫瘤淋巴管的生成提供理想實驗方法。方法 用5′?核苷酸酶（5′?Nase）酶組織化學法對30例正常胃腸新鮮標本（胃及腸組織標本各15例）進行染色觀察；用免疫組織化學PV9000法對30例相應(yīng)胃腸標本石蠟包埋組織行血管內(nèi)皮生長因子受體?3（VEGFR?3）和腎小球足突細胞膜黏蛋白（Podoplanin）染色觀察。結(jié)果 淋巴管密度（LVD）:5′?Nase組LVD為6.78±1.16，Podoplanin組為6.85±0.84，VEGFR?3組為14.33±2.24。VEGFR?3組LVD明顯高于5′?Nase組及Podoplanin組，差異均有顯著性（t＝7.55、7.49，P<0.01），Podoplanin組與5′?Nase組比較差異無顯著性（t＝0.07，P>0.05）。形態(tài)學觀察：5′?Nase及Podoplanin標記的陽性淋巴管位于黏膜固有層及黏膜下層，管壁較薄，管腔內(nèi)無紅細胞；VEGFR?3染色陽性的淋巴管較多，位于黏膜固有層及黏膜下層，部分管壁較厚，管腔內(nèi)見紅細胞，且黏膜肌也呈陽性。染色背景：Podoplanin和VEGFR?3免疫組織化學染色背景清晰，能清楚顯示陽性淋巴管與周圍組織結(jié)構(gòu)的關(guān)系；5′?Nase染色背景呈淡黃色，無法觀察淋巴管周圍的組織結(jié)構(gòu)。結(jié)論 免疫組織化學技術(shù)下Podoplanin染色可以作為標記淋巴管的理想實驗方法。Podoplanin是一種比較特異性的淋巴管標志物。
【關(guān)鍵詞】 淋巴 5 核苷酸酶 血管內(nèi)皮生長因子受體?3 腎小球足突細胞膜黏蛋白 酶組織化學 免疫組織化學
［ABSTRACT］ObjectiveTo compare different lymphatic vessel markers and labelling methods in order to find an ideal way for studying lymphangiogenesis in tumors. MethodsThirty normal gastrointestinal tissues were stained with 5′?Nase. The expression of VEGFR?3 and Podoplanin in 30 paraffin?embedded samples were examined using immunohistochemistry technique. ResultsLymphatic vessel density (LVD) was different with different staining methods: The LVD of VEGFR?3 group (14.33±2.24) was significantly higher than that of 5′?Nase group (6.78±1.16) and podoplanin group (6.85±0.84) (t＝7.55，7.49；P<0.01). There was no significant difference between 5′?Nase and podoplanin groups （t＝0.07，P>0.05）. Lymphatics positively stained by 5′?Nase and podoplanin were found in lamina propria and submucosa. The lymphatic walls were thinner and no red blood cells were found within lymphatics. VEGFR?3 positively stained lymphatics were also found in lamina propria and submucosa. Part of the lymphatic walls were thicker, and red blood cells were found in the lymphtic duct. There was a clear background after podoplanin and VEGFR?3 staining, which clearly showed the relationship between the lymphatics and the surrounding tissue, while 5′?Nase staining showed wheat color background, which obscured the surrounding tissue structure of the lymphatics. Conclusion Immunohistochemistry staining with podoplanin was an ideal method for labeling tissue lymphatics.
［KEY WORDS］lymphatics; 5′?Nase; VEGFR?3; podoplanin; enzyme histochemistry; immunohistochemistry
標記組織中淋巴管常用的方法有免疫組織化學染色檢測血管內(nèi)皮生長因子受體?3（VEGFR?3）、腎小球足突細胞黏蛋白（Podoplanin）和淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體?1（LYVE?1）等的表達，以及酶組織化學標記5′?核苷酸酶（5′?Nase)。但文獻中采用不同檢測方法和不同標記物檢測同類組織中的淋巴管數(shù)量有明顯差別，其研究結(jié)論也不一致［1,2］。因此，本研究分別應(yīng)用酶組織化學及免疫組織化學方法檢測30例正常胃腸黏膜及黏膜下層的淋巴管中5′?Nase、VEGFR?3和Podoplanin的表達，旨在尋找一種標記淋巴管的理想方法和比較特異性的標志物。
1 材料與方法
1．1 材料來源
收集青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院2005年9～12月手術(shù)切除的新鮮胃癌及結(jié)直腸癌標本中癌周正常的胃腸組織共30例（胃及腸組織標本各15例），所有標本均放入－70 ℃液氮中保存。
1．2 試劑來源
兔抗人VEGFR?3抗體（工作液）、PV9000通用型試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。鼠抗人Podoplanin單克隆抗體（稀釋度為1∶150）購自美國Angiobio公司。酶組織化學試劑：多聚甲醛（上�；瘜W試劑公司），三羥甲基氨基甲烷（Ttis，上海試劑三廠），順丁烯二酸（上海試劑三廠），腺苷5′?磷酸鈉（Sigma公司），硫酸鎂（汕頭光華化學試劑公司），硝酸鉛（中國金山化工廠），硫化胺（汕頭光華化學試劑公司）。
1．3 實驗方法
1．3．1 酶組織化學法 5 μm厚正常胃腸組織冷凍切片，用50 g/L多聚甲醛固定45 min。蒸餾水沖洗2 min，共3次。置于新鮮配置的孵育液(1.25 g/L腺苷5′?磷酸鈉20 mL，0.2 mol/L Tris?馬來酸緩沖液22 mL，20 g/L硝酸鉛3 mL，0.1 mol/L硫酸鎂5 mL)中37 ℃孵育15 min。40 g/L甲醛鹽水作用30 min。蒸餾水沖洗2 min，共3次。5～10 g/L硫化胺作用2 min。蒸餾水沖洗2 min，共3次。甘油明膠封固。
1．3．2 免疫組織化學PV 9000法染色 將冷凍切片剩余的對應(yīng)胃腸組織經(jīng)100 g/L中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，行免疫組織化學PV 9000法染色。具體步驟按說明書操作。分別用PBS代替2種一抗作陰性對照，用已知陽性組織切片作陽性對照。
1．4 結(jié)果判斷
1．4．1 5′?Nase淋巴管染色結(jié)果判斷標準 以淋巴管內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)膜呈現(xiàn)棕黃色至棕黑色沉淀為5′?Nase染色陽性。
1．4．2 Podoplanin及VEGFR?3染色結(jié)果判斷標準 以正常胃腸黏膜及黏膜下淋巴管內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為Podoplanin及VEGFR?3染色陽性判定標準。
1．4．3 淋巴管密度（LVD）的定量測定 先在低倍鏡下觀察染色陽性的淋巴管，確定淋巴管密度最高處，單個內(nèi)皮細胞著色亦作為一個計數(shù)單位，不以是否形成管腔和管腔內(nèi)有無淋巴細胞作為計數(shù)標準；然后在400倍視野下選擇5個不重復的視野計數(shù)，計算每例正常胃腸標本的單位視野（400倍）平均淋巴管數(shù)，即間質(zhì)LVD，單位為個。
1．5 統(tǒng)計學處理
采用t檢驗，所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計均在SPSS軟件上進行。
2 結(jié) 果
2．1 5′?Nase、Podoplanin和VEGFR?3在正常胃腸組織中的表達
2．1．1 形態(tài)學觀察 5′?Nase及Podoplanin染色陽性的淋巴管位于黏膜固有層及黏膜下層，大部分有腔或管腔不完整，少數(shù)呈不規(guī)則條索狀，淋巴管管壁較薄，管腔較大，有些可見一端管腔呈開放狀，管腔內(nèi)無紅細胞（圖1、2）。VEGFR?3染色陽性的淋巴管較多，位于黏膜固有層及黏膜下層，部分管壁較厚，管腔內(nèi)見紅細胞，且黏膜肌也呈陽性（圖3）。
2．1．2 染色背景 Podoplanin和VEGFR?3免疫組織化學染色背景清晰，能清楚顯示陽性淋巴管與周圍組織結(jié)構(gòu)的關(guān)系；5′?Nase染色背景呈淡黃色，無法觀察淋巴管周圍的組織結(jié)構(gòu)。
2．2 正常胃腸組織中3種染色標記LVD的比較
5′?Nase組在胃腸組織中LVD為6.78±1.16，Podoplanin組LVD為6.85±0.84，VEGFR?3組LVD為 14.33±2.24。VEGFR?3組LVD明顯高于5′?Nase組及Podoplanin組，差異均有極顯著意義（t＝7.55、7.49,P<0.01）；Podoplanin組與5′?Nase組比較，差異無顯著性（t＝0.07，P>0.05）。
3 討 論
淋巴管識別及淋巴管內(nèi)皮細胞標記是研究腫瘤淋巴管生成的基本方法之一。目前，酶組織化學5′?Nase染色法和免疫組織化學染色法是較成熟的淋巴管識別和鑒別淋巴管內(nèi)皮細胞的方法。
3．1 5′?Nase染色法在淋巴管標記中的應(yīng)用
5′?Nase存在于淋巴管內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)膜上，在血管內(nèi)皮細胞上幾乎不表達。5′?Nase染色是以腺苷5′?磷酸鈉為底物，用鎂離子作激活劑，鉛離子作捕獲劑，使生成磷酸鉛，再入硫化胺顯色，使富有5′?Nase的淋巴管壁生成棕色的硫化鉛沉淀［3～5］。許多研究采用5′?Nase染色標記淋巴管，研究腫瘤淋巴管生成的意義［2，6］。但是酶組織化學染色法，尤其5′?Nase染色很容易受實驗條件的影響，其中某一環(huán)節(jié)的改變都會對結(jié)果產(chǎn)生很大的影響。由于對酶組織化學染色的影響因素很多及各種酶之間交叉反應(yīng)的存在，雖然經(jīng)反復實驗摸索出了最佳反應(yīng)條件，但非特異性染色仍很難避免，而且背景較深，影響其結(jié)果的觀察和判定。這些因素均導致酶組織化學法在淋巴管染色中的應(yīng)用受到一定的限制。本研究染色結(jié)果顯示，5′?Nase染色標記的30例正常胃腸組織中的陽性淋巴管位于黏膜固有層及黏膜下層，其LVD為6.78±1.16，與Podoplanin組比較，沒有明顯差異。大部分有腔或管腔不完整，少數(shù)呈不規(guī)則條索狀，淋巴管壁較薄，管腔較大，管腔內(nèi)無紅細胞。但該染色法背景較深，呈淡黃色，并且無法觀察淋巴管周圍的組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果提示，5′?Nase染色法可為形態(tài)學上研究淋巴管提供較可靠的實驗方法，但非特異性染色難以避免，背景較深，影響結(jié)果的觀察和判定。
3．2 VEGFR?3和Podoplanin在淋巴管內(nèi)皮細胞標記中的應(yīng)用
目前，免疫組織化學染色法被認為是鑒別淋巴管內(nèi)皮細胞與血管內(nèi)皮細胞的最佳方法。VEGFR?3是一種酪氨酸激酶受體，是目前應(yīng)用最多的淋巴管內(nèi)皮細胞標記物，其配體VEGF?C和VEGF?D是淋巴管內(nèi)皮生長的重要調(diào)節(jié)因子。但在某些病理狀態(tài)下，VEGFR?3能夠被重新激活而發(fā)揮促血管生成活性［8］。有研究結(jié)果顯示，VEGFR?3在腫瘤血管內(nèi)皮細胞有表達，使用抗VEGFR?3抗體不能很好區(qū)分血管和淋巴管，故VEGFR?3并不被認為是淋巴管的特異性標志物。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用免疫組織化學VEGFR?3染色法，30例正常胃腸組織盡管背景清晰，能清楚顯示陽性淋巴管與周圍組織結(jié)構(gòu)的關(guān)系，但陽性表達的“淋巴管”較多，LVD為14.33±2.24，明顯高于5′?Nase組及Podoplanin組。部分管壁較厚，腔內(nèi)見紅細胞，管壁平滑肌和黏膜肌也呈陽性表達。因此，我們認為部分VEGFR?3陽性染色的“淋巴管”實際是血管，VEGFR?3不能作為淋巴管內(nèi)皮細胞的特異性標記物。
Podoplanin是一種存在于腎小球上皮細胞上的膜蛋白［9］，僅出現(xiàn)在小淋巴管，在含有平滑肌細胞的較大淋巴管內(nèi)并不出現(xiàn)，在淋巴結(jié)內(nèi)高度內(nèi)皮化的小靜脈上這種蛋白也為陰性。CURSIEFEN等［10］采用免疫金標記技術(shù)及免疫電鏡技術(shù)研究了角膜的淋巴管生成，發(fā)現(xiàn)表達Podoplanin的內(nèi)皮細胞具有淋巴管內(nèi)皮細胞的超微結(jié)構(gòu)特點。因而，Podoplanin可以作為淋巴管內(nèi)皮細胞的特異性標志物。本研究通過免疫組織化學PV 9000法檢測30例正常胃腸組織中Podoplanin的染色情況，顯示Podoplanin陽性著色的淋巴管位于黏膜固有層及黏膜下層，LVD為6.78±1.16，與5′?Nase組比較無顯著性差別。大部分有腔或管腔不完整，少數(shù)呈不規(guī)則條索狀，淋巴管壁較薄，部分管腔較大，管腔內(nèi)無紅細胞。 該染色法背景清晰，能清楚顯示陽性淋巴管與周圍組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)學關(guān)系。本文結(jié)果說明免疫組織化學技術(shù)檢測Podoplanin的染色情況可以作為標記淋巴管的理想實驗方法，Podoplanin是一種比較特異性的淋巴管標志物，可用于腫瘤淋巴管生成的研究。
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