羧甲基殼聚糖促進(jìn)牙周組織再生的安全性

【摘要】  目的 研究羧甲基殼聚糖在牙周局部應(yīng)用中的安全性。方法將32只小鼠隨機(jī)分為4組，每組8只。A組為空白對(duì)照組；B組為腹腔注射環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組；C、D組為羧甲基殼聚糖梯度實(shí)驗(yàn)組，在手術(shù)缺損區(qū)置入不同劑量的羧甲基殼聚糖。術(shù)后4周處死動(dòng)物，應(yīng)用彗星試驗(yàn)、嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)計(jì)算彗星尾數(shù)和微核率；同時(shí)收集牙周組織標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)觀察。結(jié)果術(shù)后4周C、D組骨缺損區(qū)可見(jiàn)少量新骨形成，A組未見(jiàn)明顯新骨形成；A組、C組、D組間紅細(xì)胞微核率及彗星尾數(shù)差異無(wú)顯著性(P>0.05)，而B(niǎo)組的紅細(xì)胞微核率及彗星尾數(shù)遠(yuǎn)高于A、C、D組（F=8.32、47.61，P<0.01）。結(jié)論 局部應(yīng)用羧甲基殼聚糖促進(jìn)牙周組織再生安全可靠。 
【關(guān)鍵詞】  殼聚糖；牙周組織；安全性；彗星試驗(yàn)；微核試驗(yàn)
［ABSTRACT］ Objective To study the safety of topical use of N, 0?Carboxymethy chitosan on periodontium.  MethodsThirty?two mice were equally randomized to four groups: group A, a blank group; group B, positive control group (intraperitoneal injection of cyclophosphamide, CTX); groups C and D, gradient experiment groups, different doses of N,0?Carboxymethy chitosan were implanted into the operative?defect area. The mice were killed four weeks after the procedure. Comet assay to observe the genetic toxicity and histological study were performed.  Results Newly formed bone tissue was noticed in bone defect area in groups C and D, no new bone was seen in group A. The micronucleus rate and number of comet tail in group B were much higher than that in groups A, C and D (F=8.32,47.61;P<0.01); but no significant differences were found among groups C, D and A (P>0.05). Conclusion Local application of N, 0?Carboxymethy chitosan in stimulating the periodontal regeneration is safe and reliable.
    ［KEY WORDS］ Chitosan; Periodontium; Safety; Comet assay; Micronucleus test
    牙周疾病是導(dǎo)致成年人牙齒喪失的主要病因，嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量。牙周治療的最終目標(biāo)不僅要消除致病因子，更要重建因牙周病而喪失的支持組織，恢復(fù)牙周組織的生理形態(tài)和功能，因而牙槽骨的再生就顯得尤為重要。理想的能引導(dǎo)牙槽骨再生的材料應(yīng)具有良好的生物相容性，不引起免疫排斥反應(yīng)和超敏反應(yīng)，兼具含有鈣、磷成分和引導(dǎo)骨再生的作用，無(wú)需手術(shù)提供骨源，能與人體骨整合或降解并誘導(dǎo)牙槽骨的再生和重建，同時(shí)應(yīng)取材方便、價(jià)格低廉等。目前，臨床上引導(dǎo)或誘導(dǎo)牙周組織再生的材料很多，如各種生長(zhǎng)因子及骨替代用品等。但是由于來(lái)源困難、價(jià)格昂貴、致基因突變等原因使它們?cè)谂R床上難以廣泛應(yīng)用。殼聚糖作為一種天然的生物材料，親水性好，細(xì)胞容易貼附并有一定的骨傳導(dǎo)性，不失為一種有發(fā)展?jié)摿Φ拇傺乐芑蜓啦酃窃偕�材料�?a target="_blank" title="羧">羧甲基殼聚糖是經(jīng)醚化改性后的殼聚糖，具有更高的水溶性[1]。本研究旨在探討羧甲基殼聚糖應(yīng)用于牙周局部組織的安全性，為將來(lái)羧甲基殼聚糖在臨床上的安全應(yīng)用提供參考依據(jù)。
    1       材料與方法
    1.1       試劑及儀器
    羧甲基殼聚糖（由中國(guó)海洋大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)），環(huán)磷酰胺（山東普德藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H14023686），20 g/L戊巴比妥鈉；倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，Japan），高速離心機(jī)，電泳儀，恒溫水浴箱，光學(xué)顯微鏡。
    1.2       動(dòng)物分組
    健康昆明種清潔級(jí)小鼠50只，雌雄各半，購(gòu)自青島藥物檢驗(yàn)所，合格證號(hào)：SCXK(魯)20030010，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量要求。經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后挑選體質(zhì)量30～35 g的小鼠32只，以隨機(jī)數(shù)字表法分為陰性對(duì)照組(A組)、陽(yáng)性對(duì)照組(B組)、羥甲基殼聚糖小劑量組(C組)和大劑量組(D組)，每組8只。
    1.3       動(dòng)物模型制作 
    A、C、D組小鼠均在20 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射（45 mg/kg）麻醉下行前牙區(qū)牙槽骨缺損動(dòng)物模型制作（A、C、D組制備動(dòng)物模型所用的球鉆直徑分別為0.15、0.15、0.45 cm）[2]。術(shù)后，A組小鼠直接原位縫合，C、D組小鼠按牙槽骨缺損的大小分別置入不同量的羧甲基殼聚糖，嚴(yán)密縫合手術(shù)創(chuàng)口。B組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg/kg,每天1次,連續(xù)3 d[3]。
    1.4       微核試驗(yàn)與彗星試驗(yàn)
    術(shù)后4周處死各組小鼠后，立即取胸骨骨髓，常規(guī)制片，Giemsa染色，每只小鼠油鏡下計(jì)數(shù)1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞，計(jì)算微核率[4]。同時(shí)，小鼠于處死前通過(guò)眼球取血，分離淋巴細(xì)胞完成彗星電泳，計(jì)算彗星尾數(shù)[5]。
    1.5       組織切片
    動(dòng)物處死后立即取其牙齒及牙周組織塊，置于40 g/L甲醛中固定，常規(guī)脫鈣，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木精?伊紅染色，光鏡下觀察新生牙周組織情況。
    1.6       統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    采用SPSS 13.0 及PPMS 1.5[6]統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行F檢驗(yàn)。
    2       結(jié) 果
    2.1       動(dòng)物入組情況
    經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)與挑選，最終有32只小鼠進(jìn)入本文實(shí)驗(yàn)。術(shù)后各組小鼠活動(dòng)正常、反應(yīng)靈敏，均未出現(xiàn)死亡。
    2.2       大體觀察
    各組小鼠術(shù)后創(chuàng)口愈合良好，置入材料未見(jiàn)暴露及溢出，局部軟組織充血水腫較輕，術(shù)后4周切片顯示C、D組缺損處牙槽骨有少量骨組織再生，而A組幾乎未觀察到新生骨形成。
    2.3       微核率與彗星尾數(shù)
    術(shù)后4周, B組的紅細(xì)胞微核率及彗星尾數(shù)遠(yuǎn)高于A、C、D組（F=8.32、47.61，P<0.01），而A、C、D組之間比較差異無(wú)顯著意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。
    3       討 論
    牙周組織再生是治療慢性牙周炎的最終治療目標(biāo)，可以有效保留患牙。目前，促進(jìn)牙周組織再生的材料品種較多，但各有利弊，諸多弊端使其應(yīng)用受到限制。殼聚糖作為一種來(lái)源豐富、取材方便的生物表1 羧甲基殼聚糖對(duì)小鼠嗜多染紅細(xì)胞微核率及淋巴細(xì)胞彗星尾數(shù)的影響

   材料，近年來(lái)受到國(guó)內(nèi)外各學(xué)科的廣泛重視[7]。在口腔領(lǐng)域的應(yīng)用也逐漸受到人們的重視，很多學(xué)者都已通過(guò)實(shí)驗(yàn)室或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了殼聚糖具有促進(jìn)骨組織再生修復(fù)的作用，能取得良好的引導(dǎo)牙槽骨再生的效果[8]。PARK等[9]研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖可以阻止上皮組織根方遷移，誘導(dǎo)牙周組織再生。同時(shí)，殼聚糖還可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化[10]。羧甲基殼聚糖是醚化改性后的殼聚糖，來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，理化性質(zhì)穩(wěn)定，已被應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。同時(shí)，它所具有的獨(dú)特的理化性質(zhì)、多種生物學(xué)活性如良好的生物相容性、促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的增殖、抗菌性及增加細(xì)胞黏附等，使其在牙周組織再生方面的應(yīng)用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）和國(guó)家衛(wèi)生部的規(guī)定，對(duì)于長(zhǎng)期置入機(jī)體的材料必須進(jìn)行相關(guān)毒性評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)分別采用微核試驗(yàn)和彗星電泳對(duì)其遺傳學(xué)毒性進(jìn)行測(cè)定，以期得到比較全面的評(píng)價(jià)。
    本實(shí)驗(yàn)在分組時(shí)盡量挑選體質(zhì)、健康狀況等各方面一致的小鼠，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，使結(jié)果更加精確，可重復(fù)性好。在為期30 d的實(shí)驗(yàn)期間，未出現(xiàn)動(dòng)物的死亡，有效地保存了樣本量。但在預(yù)實(shí)驗(yàn)期間，小鼠在模型制作時(shí)的死亡率高達(dá)39.8%，大多數(shù)都在手術(shù)后1 h內(nèi)死亡。分析原因可能與所給予的麻醉藥物劑量、全麻后體溫喪失過(guò)快有關(guān)[11]。
    小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)是評(píng)價(jià)環(huán)境理化因子對(duì)動(dòng)物體細(xì)胞遺傳毒性的一種常用的細(xì)胞水平的手段[5]；彗星試驗(yàn)可定性或定量分析單個(gè)細(xì)胞基因DNA單鏈斷裂水平，可用于評(píng)價(jià)細(xì)胞基因損傷[4]。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合采用這兩種檢驗(yàn)手段，希望能對(duì)羧甲基殼聚糖在牙周局部應(yīng)用中的全身的潛在遺傳毒性有一個(gè)較全面的認(rèn)識(shí)。結(jié)果表明，羧甲基殼聚糖在牙周局部應(yīng)用中未顯示毒性，這與很多學(xué)者的有關(guān)研究結(jié)論是一致的。
    綜上所述，羧甲基殼聚糖本身所具有的多種生物活性及獨(dú)特的理化性質(zhì)、良好的生物安全性，使其作為一種新型的牙周再生材料成為可能，而且具有良好的發(fā)展前景。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其在牙周組織再生中的促進(jìn)作用，但這僅限于小型缺損。由于其強(qiáng)度差、易塌陷、降解速率與新生組織的生成率不匹配等缺點(diǎn)[12]，使其在大型缺損中的應(yīng)用仍需進(jìn)一步進(jìn)行探討。
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