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聯(lián)合作用特征的評價(jià)
關(guān)鍵字： 聯(lián)合作用 評價(jià)方法摘 要：多年來，毒藥理界對機(jī)體內(nèi)多種外來化合物產(chǎn)生的聯(lián)合作用缺乏統(tǒng)一評價(jià)體系。本文就其已有的理論基礎(chǔ)和相關(guān)的方法學(xué)成就作一概述，旨在介紹各自的使用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)，提請應(yīng)用者根據(jù)條件選用合適的評價(jià)方法。
關(guān)鍵詞：聯(lián)合作用 評價(jià)方法
工農(nóng)業(yè)迅猛發(fā)展，使得地球上化學(xué)物數(shù)量不斷增加，人類在生產(chǎn)條件或生活環(huán)境中同時(shí)接觸或相繼暴露兩種及兩種以上化學(xué)物已是相當(dāng)普遍［1］。為了能取得較好的治療效果，多藥聯(lián)用或序貫用藥又是現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)的主導(dǎo)趨勢［2］。多種外來化合物共存，勢必對接觸的生物體產(chǎn)生聯(lián)合作用(joint action，combined action)，亦稱交互作用(interaction)。盡管在藥理學(xué)和毒理學(xué)中聯(lián)合作用分別發(fā)生在不同的劑量水平，對聯(lián)合作用特征的正確評價(jià)仍是兩門學(xué)科工作者的當(dāng)務(wù)之急。
在不同的時(shí)期和不同的學(xué)科領(lǐng)域，如生物學(xué)、藥理學(xué)、生物統(tǒng)計(jì)學(xué)，聯(lián)合作用具有不同的含義，特征術(shù)語亟待統(tǒng)一和規(guī)范化，對其評價(jià)方法也不盡相同［3］。Bliss在1939年最早提出獨(dú)立、相似和協(xié)同三種聯(lián)合作用模型［4］。1975年Anderson和Weber把Bliss建立模型應(yīng)用于水生毒物聯(lián)合作用研究［5］，并引入了濃度相加和反應(yīng)相加的概念。1981年WHO把聯(lián)合作用明確分為四類［6］：相加、協(xié)同、拮抗和獨(dú)立作用，這種分類方法已為多數(shù)學(xué)者所接受。1988年Rothman等又提出四種不同的聯(lián)合作用類型［7］：統(tǒng)計(jì)學(xué)、生物學(xué)、公共衛(wèi)生學(xué)和個(gè)體判別的聯(lián)合作用，不過沒有被普遍應(yīng)用。
對同一組資料應(yīng)用不同的分析方法會得出不同的結(jié)論［2］。因而就某組特定的混合物而言，很可能用一種方法計(jì)算的結(jié)論是相互協(xié)同，但用另一種方法計(jì)算的結(jié)果卻是相互拮抗。關(guān)于聯(lián)合作用特征的評價(jià)，國內(nèi)外尚未形成統(tǒng)一的認(rèn)識體系［8，9］。
1 等效應(yīng)線圖法
1870年Fraser倡導(dǎo)，1926年Loewe加以發(fā)展的等效應(yīng)線圖法［10］，是先用加權(quán)直線回歸法求出單獨(dú)與混合后的LD50，再求其毒性比例TR值，以TR界值來反映結(jié)果性質(zhì)。在試驗(yàn)條件和接觸途徑相同的情況下，分別求出兩個(gè)化學(xué)物的LD50及其95％可信限，用縱、橫坐標(biāo)分別代表兩種化學(xué)物的劑量并將取得的同一效應(yīng)的劑量(LD50)點(diǎn)相連即為等效線，然后再將兩化學(xué)物的95％可信限的上、下限值分別連接。依據(jù)混合物實(shí)測LD50在兩種化學(xué)物可信限上、下連線之間位置判定聯(lián)合作用的特征。該法簡單，結(jié)果直觀，適用于粗略觀察。但是只能評價(jià)兩個(gè)化學(xué)物的聯(lián)合作用，與其嚴(yán)密的設(shè)計(jì)相比信息利用度不夠，也不適用于非概率型效應(yīng)指標(biāo)資料。
Checkerboard titration法就是基于等效應(yīng)線圖法思想的一個(gè)延伸［11］，可以從代數(shù)和幾何兩個(gè)角度加以判斷，Berenbaum同時(shí)又將此法推廣到求任意數(shù)量藥物的聯(lián)合作用。等效應(yīng)劑量分析會受許多因素的影響，且方法本身往往因?yàn)榧夹g(shù)上的差錯(cuò)產(chǎn)生一些差異值，可比性比較差，重復(fù)步驟太多。
Finney根據(jù)Loewe法的劑量比例原則，提出了以各成分LD50為基礎(chǔ)，評價(jià)相似聯(lián)合作用的調(diào)和平均數(shù)模型，來確定混合物的預(yù)期LD50。由于簡便易行，經(jīng)多數(shù)學(xué)者證實(shí)能較好地預(yù)測和評價(jià)聯(lián)合毒性。它是在先求出各化學(xué)物的各自LD50值，以各化學(xué)物的聯(lián)合作用是相加作用的假設(shè)出發(fā)，按等毒效應(yīng)劑量預(yù)測混合化學(xué)物的LD50。用與計(jì)算預(yù)期PLD50時(shí)相同配比的混合物作動物實(shí)驗(yàn)，求出實(shí)測半數(shù)致死量OLD50和混合物的PLD50與OLD50的比值，即聯(lián)合作用系數(shù)Q，實(shí)測值小于預(yù)測值為協(xié)同作用，反之為拮抗作用。
Keplinger等用有機(jī)磷、有機(jī)氯和氨基甲酸酯等15種農(nóng)藥［12］，按等毒性配比得100多種混合物，分別求得PLD50／OLD50，據(jù)此提出了0.57～1.75之間為相加作用的標(biāo)準(zhǔn)。Smyth將27種化學(xué)物［13］，同樣按等毒性配比，配成350種混合物，進(jìn)行小鼠聯(lián)合毒性試驗(yàn)，建議按Finney數(shù)學(xué)模型計(jì)算的Q值在0.40～2.70之間屬相加作用。河合正計(jì)、巖原滋利曾用此法對8種殺蟲劑和4種殺菌劑配成28個(gè)混合物進(jìn)行測定［14］，提出不同的Q值評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。
采用Finney的Q值評價(jià)聯(lián)合作用特征［15］，因其毒物種類、實(shí)驗(yàn)條件和動物種屬的差異，以及經(jīng)驗(yàn)估計(jì)范圍的不同而使之缺乏可比性。Abt等人提出以O(shè)LD50／PLD50作為Q值，其具體分界線用其建議的計(jì)算偏離‘1’的程度公式，然而計(jì)算太繁，應(yīng)用不便。
Finney法又在生態(tài)毒理學(xué)中得到應(yīng)用和擴(kuò)展［16］，采用等毒性混合法比較預(yù)期EC50和實(shí)測EC50，由毒性加強(qiáng)指數(shù)TEI來評價(jià)其特征。Kissinl等提出的分?jǐn)?shù)(代數(shù))分析法［17］，基本思路與等效應(yīng)線圖法類同，但允許A、B兩藥以任意比例合用，適用范圍廣，國內(nèi)仍在采用。1977年Marking提出的相加指數(shù)法是在濃度相加模式基礎(chǔ)上建立的，需要獲得每個(gè)單一毒物的LC50i和在一定比例下幾個(gè)毒物混合的LC50i＇，以及1981年荷蘭學(xué)者Knemann的聯(lián)合毒性指數(shù)法幾乎是同一思想［18］。
Moshkovsky曾提出將傳統(tǒng)分類法中的相加作用域定義為完全相加［19］，而從拮抗域中劃分出部分相加和掩蓋作用區(qū)。導(dǎo)致部分相加作用的原因，一般認(rèn)為是毒物在體內(nèi)的代謝動力學(xué)不一致，以及一些用不同順序染毒或時(shí)間間隔染毒。于鳴按Moshkovsky分類理論發(fā)展了Finney模型［20］，又提出一個(gè)新的Q值評價(jià)系統(tǒng)，杜絕了Keplinger，Smyth等標(biāo)準(zhǔn)的主觀性和拮抗作用的假陽性。大致過程包括計(jì)算各組分及混合物L(fēng)D50，并由Finney相加作用理論公式求出預(yù)期LD50，求出Q值及其標(biāo)準(zhǔn)誤和兩倍誤差的可信限范圍。以此可信限與完全相加理論值1，掩蓋作用理論值1／Pm作比較，判定聯(lián)合作用。于鳴應(yīng)用Q值系統(tǒng)對乙醛和丁烯醛的聯(lián)合毒性研究資料進(jìn)行了分析，結(jié)論與采用Finney改良模型的處理結(jié)果相吻合。等效應(yīng)圖解分析法在國外應(yīng)用較多［21］，思路和求法與Loewe法類同，只是將它轉(zhuǎn)換成平行線分析，增加了統(tǒng)計(jì)學(xué)處理［22］。
2 Bliss法
Bliss提出根據(jù)劑量對數(shù)與死亡概率直線回歸方程［23，24］，以及化學(xué)物之間聯(lián)合作用模式，確定基本模型表達(dá)式：
Ym＝a＋bLog（Q1＋kQ2＋KkQ1Q2）Xm
Ym：混合物的死亡概率，
k：兩種化學(xué)物的毒性比值，
Q1，Q2：兩種化學(xué)物的百分比，
Xm：混合物的劑量，
K：共毒系數(shù)，
a，b：方程的截距和斜率。
結(jié)果以相加聯(lián)合作用時(shí)的死亡概率為標(biāo)準(zhǔn)(理論值)與實(shí)測值比較計(jì)算共毒系數(shù)K，K＞0表示協(xié)同作用，K＜0拮抗作用，K＝0相加作用。該法考慮了混合物毒作用機(jī)制的差別，能較好地對外來化合物的聯(lián)合作用進(jìn)行定量評價(jià)，然而計(jì)算太復(fù)雜，不便推廣。
3 BÜrgi法
合并用藥在臨床上是普遍使用的治療手段，以往均延用BÜrgi氏規(guī)律公式來判斷合并用藥后的最終效應(yīng)：q＝E［A／2＋B／2］／EA(或EB)，式中E［A／2＋B／2］指A、B兩藥各取半量合用之效應(yīng)，EA、EB分別為A、B單用之效應(yīng)，且EA＝EB。Savini即用此法求5HT及腎上腺素的合并作用。
然而，金正均指出上述方程中，分子應(yīng)采用原始效應(yīng)之半，分母應(yīng)考慮兩藥聯(lián)合作用時(shí)的新情況，并提出金氏修正式：q＝E（A＋B)／（EA＋EB－EA・EB)。式中分子代表實(shí)測合并效應(yīng)，分母是期望合并效應(yīng)，其意義同Brgi式。修正式的優(yōu)點(diǎn)是不必取半量或半效，可以直接利用原始效應(yīng)水平，兩藥效應(yīng)也不必相同。但只適用于定性試驗(yàn)。
周元晏等提出兩個(gè)新公式：q′＝〔E（A＋B）－EB〕／EA(合并用藥用，要求EA＝EB)，q″＝E′C／EC(序貫用藥用，EC為A藥的對照效應(yīng)，E′C為在B藥基礎(chǔ)上的A藥效應(yīng))，并認(rèn)為金氏修正式把概率論中衡量兩個(gè)獨(dú)立事件概率相加的公式來衡量合并用藥效應(yīng)期望值，缺乏理論基礎(chǔ)，且沒有考慮A、B兩藥在合并前后的內(nèi)在活性，混淆了效應(yīng)和概率兩個(gè)不同的概念。
Mansour等報(bào)道了按等毒法評價(jià)二元混合物的聯(lián)合毒性［25］。方法是按各化學(xué)物預(yù)期死亡25％的劑量混合染毒，預(yù)期死亡率應(yīng)為50％，由實(shí)測混合物死亡率和預(yù)期死亡率計(jì)算共毒系數(shù)，評價(jià)混合物的聯(lián)合毒性。Harris等采用按LD50配制二元等毒混合物來評價(jià)聯(lián)合毒性的方法［26］。測定兩種化合物的LD50及其可信限，按混合比例和各自的LD50值推算預(yù)測LD50及其可信限，預(yù)測LD50與實(shí)測LD50之比。同時(shí)根據(jù)實(shí)測值與預(yù)測值的可信區(qū)間是否相覆蓋進(jìn)行分析，相覆蓋者聯(lián)合作用較弱，反之則強(qiáng)。
4 等概率和曲線法
有時(shí)，合并用藥可利用獨(dú)立事件相加概率公式，張效文、金正均提出按效應(yīng)相加的等概率和曲線法。根據(jù)混合物中各化學(xué)物的劑量－死亡概率回歸曲線求出預(yù)期死亡概率，再對概率求和推算死亡率。Q＝實(shí)際合并效果／理論單純相加預(yù)期效果。在實(shí)驗(yàn)室中多采用LD50或ED50作為指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)量Q50計(jì)算：Q50＝0.5／（PA＋PB－PAPB)。兩個(gè)以上藥物可先從兩個(gè)主藥著手，然后將合并效果作為單一效果，再與其他藥物合并估算。既適合基礎(chǔ)理論研究，又適合聯(lián)合用藥臨床療效和副作用的估計(jì)。等概率和曲線法能給出合并用藥的全貌，省卻運(yùn)算時(shí)間，有一定理論基礎(chǔ)。以等概率和曲線法求得的LD50值一般比等效線圖法求得的TR值要大［27］，即所判斷的聯(lián)合毒性普遍要大于后者。5 方差分析法
近年來，許多毒理學(xué)科研人員在研究中采用析因設(shè)計(jì)的方差分析來判斷外來化合物聯(lián)合作用特征。將單因素的劑量-效應(yīng)曲線和聯(lián)合作用的劑量-效應(yīng)曲線進(jìn)行重復(fù)設(shè)計(jì)的方差分析，以確定各因素之間有無交互作用［8，29］。如2×2析因試驗(yàn)是用于兩個(gè)因素(兩個(gè)藥物或兩種處理方法)［30］，每個(gè)因素有兩個(gè)水平(用與不用或劑量的不同)的情況。如交互作用不顯著，兩條量效曲線互相平行，則說明兩因素之間具有相加作用。如交互作用顯著，兩曲線隨劑量增大而遠(yuǎn)離，兩因素之間具有協(xié)同作用。反之，如兩曲線隨劑量增大而靠近或交叉，兩因素之間具有拮抗作用。該方法是一種比較經(jīng)典的統(tǒng)計(jì)方法［31］，它可以直接利用連續(xù)的測定結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，從而充分利用了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中所含的信息。
6 Logistic模型評價(jià)法
黃炳榮等提出的用Logistic模型評價(jià)和確定毒物聯(lián)合作用的劑量-反應(yīng)關(guān)系［32］，ED50集合及其置信區(qū)域等，具有客觀和適用范圍廣的特點(diǎn)，為深入研究毒物聯(lián)合作用提供了一種新的方法。其描述毒物聯(lián)合作用的Logistic模型的基本形式為：Ln〔P／（1－P）〕＝β0＋β1x1＋β2x2＋β3x1x2，P為反應(yīng)概率。xi為各毒物的劑量，βi為模型參數(shù)，β3是交互作用參數(shù)。β3＞0表示協(xié)同作用，β3＜0拮抗作用，β3＝0(即β3無顯著性)表示相加作用。βi的極大似然估計(jì)值通常是用Newton Raphson選代法求出，Logistic模型ED50及其漸近置信區(qū)域可用Carter等的方法估計(jì)。根據(jù)Hauck的結(jié)論S50(B)的1－α保守置信區(qū)域可近似地由下式確定：｛ξ∈R2｜PL（x）≤［1＋Exp（1－ξB）］－1≤PU（x）x*∈S50（B）｝
黃炳榮等以硝酸鉛與無水乙醇為例，在計(jì)算機(jī)上用WLOGIT軟件解出各參數(shù)極大似然估計(jì)值，結(jié)果β3＞0，模型的似然比檢驗(yàn)說明整個(gè)模型有顯著性。擬合適度檢驗(yàn)P＞0.50可認(rèn)為模型對數(shù)據(jù)擬合情況良好。聯(lián)合作用劑量-反應(yīng)關(guān)系和LD50集合及其95％置信區(qū)域的結(jié)果最終可在二維、三維空間中擬合。
選用概率效應(yīng)指標(biāo)對聯(lián)合作用評價(jià)在實(shí)際應(yīng)用中有一定局限性，如對外來化合物長期低劑量暴露，或是在細(xì)胞、亞細(xì)胞水平觀察的聯(lián)合作用進(jìn)行評價(jià)時(shí)，就不宜使用LD50或ED50指標(biāo)。改用非概率指標(biāo)以后，化學(xué)物單獨(dú)作用的劑量-效應(yīng)關(guān)系有可能需用非單調(diào)型曲線描述，同時(shí)效應(yīng)指標(biāo)觀察值也無≤1的限制。張俠提出對聯(lián)合作用劑量反應(yīng)關(guān)系采用廣義三階多項(xiàng)式回歸模型評價(jià)方法［33］：
R（x，y）＝R0＋α1x＋α2x2＋α3x3＋β1y＋β2y2＋β3y3＋γ1xy＋γ2x2y＋γ3xy2交互項(xiàng)之和γ1xy＋γ2x2y＋γ3xy2記為I(x，y)。x、y表示兩種受試物各自的劑量，R（x，y)表示效應(yīng)指標(biāo)的觀察值R（x，y)的模擬預(yù)測值，R0、αi、βi、γi(i＝1，2，3)是回歸方程的參數(shù)。交互項(xiàng)之和及其置信區(qū)間估計(jì)為：R∧（x，y）－R0－〔（R（x，0）－R0〕＋〔R∧（x，y）－R0）〕＝I（x，y)
從理論上講，I（x，y)＝0即兩種化學(xué)物的聯(lián)合作用是簡單相加。I（x，y)＞0或＜0分別表示協(xié)同或拮抗。I（x，y)的符號是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義可由I（x，y)的1－α置信區(qū)間加以判定。以氯化鎘與氯化鎳對豚鼠肺泡巨噬細(xì)胞膜的聯(lián)合毒性為例進(jìn)行了演示，判定結(jié)果與采用Logistic模型評價(jià)結(jié)果相一致。
研究固定劑量或固定比例設(shè)計(jì)下的聯(lián)合作用資料時(shí)，其單獨(dú)或聯(lián)合的量-效曲線散點(diǎn)圖是三次拋物線型，其資料符合三階多項(xiàng)式模型的重要特征。已有文獻(xiàn)報(bào)道不同效應(yīng)水平(如ED50，ED60等)所對應(yīng)的聯(lián)合作用特征可能有不一致［34，22］，而該模型卻能成功地解決這一問題。這是三階以下模型所不具備的。使用本法簡單有效，客觀而適用范圍寬。
7 多藥物聯(lián)合作用計(jì)算機(jī)分析法
很多藥物往往不能用較大劑量治療疾病，但為了要達(dá)到較好的治療效果常需合并用藥。徐端正提出多藥物合并指標(biāo)Q（x）及95％可信限［35］，在計(jì)算機(jī)上對所有反應(yīng)水平(1％～99％)進(jìn)行評價(jià)，多藥物的合并公式：
�。╬1／D1x＋p2／D2x＋pn／Dnx)Dcx＝Q（x）
d1／D1x＋d2／D2x＋…dn／Dnx＝1
應(yīng)用Bliss法可求出幾個(gè)藥物在合并前后的任何反應(yīng)水平x％的等效劑量D1x、D2x、…Dnx及Dcx，利用計(jì)算機(jī)可繪出Q（x）曲線，Q（x)的標(biāo)準(zhǔn)誤公式可用函數(shù)方差原理導(dǎo)出。其中Scx2為Dcx的估計(jì)方差，Six2為Dix的估計(jì)方差。利用Q（x）的95％可信限公式：Q（x）±1.96SE〔Q（x）〕，繪出以Q（x）曲線為中心的兩條95％可信限曲線，在上、下限曲線范圍內(nèi)包含水平線Q（x）＝1為相加作用。
Finney在1962年最先提出，Plummer和Short后又加以改進(jìn)的多藥物聯(lián)用的計(jì)算機(jī)分析模型［36］，區(qū)分相加作用中的協(xié)同還是拮抗，適用于質(zhì)反應(yīng)或量反應(yīng)(經(jīng)概率單位或?qū)?shù)轉(zhuǎn)換)資料，不須預(yù)先掌握精確的等效劑量信息，對數(shù)劑量-反應(yīng)曲線不再拘泥于平行關(guān)系，對單藥或具有相同效應(yīng)的多藥合用同樣適用，具體表達(dá)式為：Y＝β0＋β1lg［A＋P・B＋β4（A・P・B)1／2］。Y是反應(yīng)，A、B為兩藥的劑量，P為相對效率，可由lg（P）＝β2＋β3lg（B′）求得，B′－B－A／P＝0。如兩藥曲線平行，β3＝0，P為常數(shù)。β4＞0判為協(xié)同，β4＜0拮抗。對β4應(yīng)作是否等于0的顯著性檢驗(yàn)。
8 參數(shù)法分析多藥物聯(lián)合作用
鄭青山、孫瑞元根據(jù)靶體動力學(xué)原理［37］，引入藥物等效性檢驗(yàn)法，建立新的數(shù)學(xué)模型Q＝（E0-Ee)／｜Ee・W－sx・T｜分析多藥物聯(lián)用效果，其中E0為藥物聯(lián)用實(shí)測效應(yīng)擬合值，Ee為聯(lián)用藥效期望值，W為專業(yè)等效標(biāo)準(zhǔn)，一般在臨床試驗(yàn)和整體實(shí)驗(yàn)中為0.1，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為0.05，生物利用度實(shí)驗(yàn)為0.2。sx為E0和Ee共同標(biāo)準(zhǔn)誤，T是單側(cè)t0.05值，分析用的一組Q值來自于各種水平的劑量-效應(yīng)關(guān)系。本法適用于能用Hill方程進(jìn)行擬合，且質(zhì)反應(yīng)Emax固定為1（100％）的數(shù)據(jù)。所得結(jié)論綜合了專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)室誤差的因素，有效地分析多種類型聯(lián)用數(shù)據(jù)，不受聯(lián)用藥物數(shù)目和是否作用于受體的限制。
9 合并用藥的定量分析法
戴體俊(1998)建議采用如下公式評價(jià)合并用藥的效果［38］：
qA＝EA＋BVsEA �。�1）
qB＝EA＋BVsEB （2）
qC＝EA＋BVsEA＋Ab(EB＋Ba) �。�3）
VS表示用藥前后的效應(yīng)做顯著性檢驗(yàn)。（1）式若EA＋B大于(小于)EA，且qA的P值＞0.05，定義為B藥對A藥無關(guān)；P＜0.05認(rèn)為A藥被B藥協(xié)同(拮抗)。（2）式亦然。（3）是針對A、B兩藥而定的。按等效劑量合并法將A、B合并為一藥A＋Ab（B＋Ba)，再將其實(shí)測效應(yīng)EA＋Ab(EB＋Ba)進(jìn)行比較。
以上羅列各法對聯(lián)合作用進(jìn)行定性或定量評價(jià)，均有各自的使用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)。聯(lián)合作用特征又可隨觀察指標(biāo)(如ED50、死亡率、麻醉以及生理、生化等指標(biāo))不同而有差別，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不宜任意外延。具體應(yīng)用時(shí)須嚴(yán)格根據(jù)條件選擇合適方法。在基礎(chǔ)理論研究中［39～41］，更多的是從細(xì)胞分子水平或在藥代動力學(xué)模型上進(jìn)行評價(jià)。
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