人突變CD59的表達(dá)、純化及抗原性鑒定

【摘要】  目的 獲得純化人突變CD59(hmCD59)蛋白，制備其特異性抗體，對純化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。方法 將含有hmCD59全長序列的重組pALTER質(zhì)粒,運用脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,采用SDS?PAGE檢測hmCD59的表達(dá)情況，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)ANTI?FLAG M2 Affinity Gel純化后制備抗血清，以此抗血清鑒定純化產(chǎn)物。結(jié)果 hmCD59在CHO細(xì)胞獲得表達(dá)，ANTI?FLAG M2 Affinity Gel純化后可獲得電泳純的hmCD59蛋白，hmCD59與小鼠抗hmCD59抗血清具有特異性反應(yīng)。結(jié)論 從真核細(xì)胞獲得了電泳純并具有抗原性的hmCD59蛋白，為進(jìn)一步對其進(jìn)行抗體制備、功能研究及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 
【關(guān)鍵詞】  人突變CD59 真核細(xì)胞表達(dá) 純化 抗原性
［ABSTRACT］ObjectiveTo obtain purified human mutant CD59 (hmCD59) protein and to identify the purified product with specific antiserum against hmCD59 protein.MethodsThe recombinant pALTER plasmid containing hmCD59 cDNA was transfected into CHO cells with pcDNA3 by lipofectamine. Expression of hmCD59 on CHO cells was detected by SDS?PAGE. The recombinant protein was purified by ANTI?FLAG M2 Affinity Gel. The antiserum was prepared with the purified hmCD59 and used to identify the purified hmCD59.ResultshmCD59 protein was purified by ANTI?FLAG M2 Affinity Gel. Furthermore, hmCD59 had specific reactivity with mouse anti?hmCD59 antiserum.ConclusionThe purified hmCD59 protein has been obtained successfully, which lays the foundation for preparing antibody, further functional study and clinical application of hmCD59.
    ［KEY WORDS］human mutant CD59; eukaryotic cells expression; purification； antigenicity
    CD59是一種廣泛分布于組織細(xì)胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨固膜蛋白,相對分子質(zhì)量較小,只有  20 000左右,在補體活化通路的不同階段限制補體活化，成為攻膜復(fù)合體（MAC）形成的關(guān)鍵抑制物,從而保護(hù)自身正常的組織細(xì)胞免受補體損傷［1］。國內(nèi)外研究顯示，人CD59糖化后失去抑制MAC的功能［2］，突變?nèi)薈D59(hmCD59)在高糖環(huán)境下更加易于糖化失活，抗補體活性更快降低［3］ ，MAC沉積增加，內(nèi)皮釋放生長因子，引發(fā)糖尿病病人血管增殖［4］。人類糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生的潛在機制仍然不十分清楚，尤其是hmCD59與糖尿病并發(fā)癥的相關(guān)性鮮有報道。本研究報道hmCD59蛋白的表達(dá)、提取、純化及抗原性鑒定，為下一步制備抗hmCD59單克隆抗體并對其進(jìn)行臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。
    1  材料和方法
    1.1  材料
    1.1.1  質(zhì)粒、菌株與細(xì)胞株  質(zhì)粒hmCD59?PALTER由本室構(gòu)建保存。pcDNA3由美國哈佛大學(xué)提供。CHO細(xì)胞株由本室保存。
    1.1.2  主要試劑  EcoRⅠ購自寶生物大連有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購自HyClone公司。小牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品。G418選擇性抗生素購自于Amresco公司。LipofectamineTM2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。ANTI?FLAG M2 Affinity Gel Freezer?Safe為Sigma?Aldrich公司產(chǎn)品。Vivaspin 2超濾濃縮離心管為Sartorius公司產(chǎn)品。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均為Sigma公司產(chǎn)品。HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。
    1.2  實驗方法
    1.2.1  質(zhì)粒hmCD59?PALTER的鑒定  將hmCD59?PALTER質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ酶切鑒定并經(jīng)上海生物工程公司測序確認(rèn)。
    1.2.2  hmCD59在CHO細(xì)胞中的表達(dá)  重組質(zhì)粒hmCD59?PALTER對CHO細(xì)胞的轉(zhuǎn)染,參照LipofectamineTM 2000的說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后24 h將細(xì)胞作1∶10稀釋后傳代,48 h后加入選擇培養(yǎng)液(含有800 mg/L的G418)篩選陽性克隆2周，挑取單個克隆,繼續(xù)抗性篩選2周,其陽性克隆的后續(xù)培養(yǎng)始終在G418維持劑量(400 mg/L)下進(jìn)行。收集生長狀態(tài)良好的陽性CHO細(xì)胞，裂解后離心取上清以SDS?聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）鑒定蛋白的表達(dá)。
    1.2.3  目的蛋白hmCD59的純化  獲取生長良好的107～108個轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞 ，加入細(xì)胞裂解液(含50 mmol/L Tris HCl,pH 7.4, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA,體積分?jǐn)?shù)0.01的TRITONX?100)10 mL,冰上振蕩裂解30 min后低溫離心取上清待用。將ANTI?FLAG M2 Affinity Gel裝柱并靜置，待填料完全沉降后，用TBS （其中含50 mmol/L Tris HCl,150 mmol/L NaCl, pH 7.4)沖洗，連續(xù)加3次柱體積的0.1 mol/L甘氨酸HCl (pH 3.5)洗膠，再以TBS在4 ℃平衡樹脂。加入總蛋白提取物，在重力作用下多次流經(jīng)親和柱，保持 4 ℃，控制流量為1 mL/min,再用10～20個柱容積的TBS沖洗，去掉未結(jié)合的雜蛋白，經(jīng)磺硫酸檢測無蛋白流出。然后用6個1 mL的0.1 mol/L甘氨酸HCl (pH 3.5)進(jìn)行洗脫，分別收集入6個含有20 μL 1.0 mol/L Tris (pH 8.0)的管中。
    1.2.4  hmCD59的SDS?PAGE鑒定  SDS?PAGE中使用120 g/L的分離膠和50 g/L的濃縮膠。將收集的洗脫峰蛋白2 mL裝入Vivaspin 2超濾濃縮離心管中，3 000 r/min離心12 min進(jìn)行濃縮至濃度為1 g/L。取20 μL濃縮后樣品與等體積2×上樣緩沖液混勻后，在沸水浴中加熱5 min,上樣，起始電壓為70 V。當(dāng)樣品移出濃縮膠與分離膠的分界處時，加大電壓到100 V至電泳終了，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后觀察結(jié)果。
    1.2.5  小鼠抗hmCD59抗血清的制備  將hmCD59與等體積弗氏完全佐劑制成乳化劑，以10 μg劑量多點注射于2只6～8周齡雌性BALB/C小鼠的背部，21 d后以同樣劑量的hmCD59與弗氏不完全佐劑乳化進(jìn)行第一次加強免疫，背部皮下多點注射，14 d后以同樣方法進(jìn)行第2次加強免疫。10 d后斷尾采血制備抗血清。將hmCD59蛋白進(jìn)行稀釋（2、10 mg/L）后包被，均設(shè)3個復(fù)孔。以酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定抗血清的效價，免疫前小鼠血清作為陰性對照。
    2  結(jié)    果
    2.1  質(zhì)粒hmCD59?PALTER的鑒定
    以EcoRⅠ對hmCD59?PALTER進(jìn)行酶切，獲得1條496 bp的電泳帶,與插入的目的基因片段大小相一致（圖1）。測序結(jié)果表明, hmCD59?PALTER59含有突變的CD59全長cDNA序列。
    2.2  目的蛋白hmCD59的表達(dá) 
    已轉(zhuǎn)染hmCD59?PALTER的CHO細(xì)胞SDS?PAGE分析顯示，在相對分子質(zhì)量為20 000處出現(xiàn)條帶（圖2），同預(yù)期結(jié)果一致。
    2.3  目的蛋白hmCD59的純化 
    將轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞總蛋白提取物經(jīng)過ANTI?FLAG M2 Affinity Gel親和層析純化，收集洗脫液，濃縮后經(jīng)SDS?PAGE并用考馬斯亮藍(lán)染色顯示，得到電泳純hmCD59蛋白（圖3）。
    2.4  抗hmCD59抗血清的制備及鑒定
    以純化的hmCD59為免疫原，免疫2只BALB/C小鼠，在2次加強免疫后取血制備抗血清，2只小鼠的抗血清效價均在1∶10 000以上，免疫前血清與hmCD59無特異性反應(yīng)，表明獲得了抗hmCD59的抗血清。
    3  討    論
    糖尿病血管增殖癥是嚴(yán)重危害糖尿病病人的并發(fā)癥，明確糖尿病血管增殖癥的發(fā)病機制并有效防治，是目前糖尿病診斷及治療領(lǐng)域中的重點。研究證實，CD59作為一種補體調(diào)節(jié)蛋白，可阻止MAC形成，對于保護(hù)自身細(xì)胞免受補體損傷起到了關(guān)鍵的作用［ 5,6］。對CD59結(jié)構(gòu)及功能的研究揭示，人類CD59分子存在易于糖基化位點K41?H44［7］，糖化人CD59失去了MAC的抑制功能［2］。近年來，有研究表明，人CD59糖基化位點突變后在高糖環(huán)境下更加易于糖基化而失去抗補體活性［3］，致使MAC大量沉積于血管內(nèi)皮，促使血管內(nèi)皮釋放成纖維細(xì)胞生長因子、血小板源性生長因子，刺激成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞過度增殖，從而發(fā)生血管增殖癥及硬化癥［4］。因此,有學(xué)者推測糖尿病病人體內(nèi)存在CD59基因突變，但目前國內(nèi)外尚無能夠用于檢測抗hmCD59的抗體，hmCD59的提取、純化及鑒定國內(nèi)外也尚未見報道。

    本實驗將重組的hmCD59?PALTER質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，長期實驗及鑒定表明,hmCD59可以在CHO細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)。通過培養(yǎng)表達(dá)hmCD59的CHO細(xì)胞，并將其總蛋白提取物用親和層析法進(jìn)行純化，經(jīng)鑒定表明得到了電泳純的hmCD59蛋白。本研究設(shè)計具有以下特點：①選用CHO這種低表達(dá)非特異性蛋白的哺乳動物細(xì)胞系用來進(jìn)行重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，保證了特異性目的蛋白穩(wěn)定表達(dá)。②采用Sigma?Aldrich公司的ANTI?FLAG M2 Affinity Gel進(jìn)行純化，國內(nèi)尚無報道。本產(chǎn)品通過氫鍵將純化的單克隆抗體共價結(jié)合在瓊脂糖上，可用于FLAG融合蛋白的純化，其結(jié)合FLAG肽是非鈣依賴性的。ANTI?FLAG M2 Affinity Gel具有手工操作方便、化學(xué)物理穩(wěn)定性強、可再生重復(fù)利用、特異性強、回收率高等優(yōu)點，由于本實驗中hmCD59?PALTER重組質(zhì)粒設(shè)計含有FLAG序列，利用細(xì)胞表達(dá)FLAG與親和膠抗FLAG單克隆抗體特異性結(jié)合可獲得高純度的FLAG融合蛋白。③以純化的hmCD59為免疫原制備了高效價的抗血清，說明獲得的hmCD59具有較強的抗原性。鑒于hmCD59在人類糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生及診斷中的重要性，本文獲得了電泳純的hmCD59蛋白及其抗血清，為下一步制備其單克隆抗體，進(jìn)一步明確人突變CD59與人類糖尿病血管并發(fā)癥之間的分子機制、潛在關(guān)系及臨床糖尿病的診斷奠定了堅實的基礎(chǔ)。
 
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