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三葉青的毒理學(xué)研究
關(guān)鍵字: 毒理學(xué)三葉青為葡萄科植物三葉崖爬滕Tetrastigma hems-leyanum Diels et Gilg的根 [1] ,又名金線吊葫蘆、石老鼠。在浙江民間素有食用習(xí)俗,為評價其安全性。我們按《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)中“食品安全性毒理學(xué)評價試驗”進行實驗 [2] ,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。
1 樣品
三葉青塊根,切片,10倍水浸泡2h,每次1h,收集煎液。濃縮成1g生藥/ml濃度,由杭州天惠醫(yī)藥科技有限公司提供。按民間食用習(xí)慣15g/人/d計算。
2 實驗動物和檢測條件
實驗用ICR小鼠由浙江省實驗動物中心提供,清潔級,醫(yī)學(xué)實驗動物合格證號為2001001,醫(yī)學(xué)實驗動物設(shè)施合格證號為2001001。實驗用SD大鼠由浙江省實驗動物中心提供,清潔級:醫(yī)學(xué)實驗動物合格證號為2001001,醫(yī)學(xué)實驗動物設(shè)施合格證號為2001001。實驗動物飼料由浙江省實驗動物中心提供,執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)GB14925-2001。檢測環(huán)境條件:溫度范圍20℃~25℃,相對濕度范圍60%~70%。實驗動物試驗前在動物房環(huán)境中適應(yīng)3天,染毒前禁食過夜,不限制飲水。
3 實驗方法
3.1 大鼠急性經(jīng)口毒性試驗
3.1.1 實驗動物 選用健康、成熟、體重180~220g SD大鼠20只,雌雄各半。
3.1.2 劑量和給藥方法 按最大耐受量試驗方法將大鼠分為10.0g/kg,體重劑量組,每組20只,雌雄各半。大鼠灌胃前停食16h。連續(xù)觀察14天,并記錄動物中毒癥狀及死亡情況。
3.1.3 觀察指標(biāo) 染毒后,觀察大鼠的一般狀況、中毒癥狀和死亡情況,觀察期限2周。
3.2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗
3.2.1 實驗動物 選用健康、成熟、休重18~22g ICR小鼠20只,雌雄各半。
3.2.2 劑量和給藥方法 按最大耐受量試驗方法將小鼠分為40.0g/kg體重劑量組,每組20只,雌雄各半。小鼠灌胃前停食16h。連續(xù)觀察14天,并記錄動物中毒癥狀及死亡情況。
3.2.3 觀察指標(biāo) 染毒后,觀察小鼠的一般狀況、中毒癥狀和死亡情況,觀察期限兩周。3.3 Ames試驗
3.3.1 試驗菌株 選用組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌,共四株,即TA 97a 、TA 98 、TA 100 、TA 102 。由上海勞動衛(wèi)生職業(yè)病研究所提供,經(jīng)生物學(xué)鑒定合格后進行試驗。
3.3.2 劑量選擇及陽性對照物 試驗采用平板摻入法。樣品以蒸餾水稀釋至相應(yīng)劑量。用TA 100 菌株的非代謝活化系統(tǒng)進行預(yù)試驗,結(jié)果在劑量為5000μg/皿時未出現(xiàn)明顯的增菌和抑菌現(xiàn)象,故正式試驗時選擇試驗濃度為8、40、200、1000、5000μg/皿5個劑量組,外加陰性對照(蒸餾水,DMSO)和陽性對照組(9-氨基吖啶、2,7-二氨基芴、疊氮鈉、2-乙酰氨基芴、絲裂霉素C、1,8-二羥基蒽醌),每種菌株每個測試濃度設(shè)三皿平行,在加和不加S 9 條件下進行試驗。 3.3.3 觀察指標(biāo) 直接計數(shù)培養(yǎng)基上各菌株的回菌落數(shù)。
3.4 小鼠骨髓細胞微核試驗
3.4.1 實驗動物 實驗用ICR小鼠由浙江省實驗動物中心提供,體重25~28g。
3.4.2 劑量和給藥方法 小鼠隨機分5.0、10.0、20.0g/kg體重三個劑量組,一個陰性對照組(灌胃等容量蒸餾水)和一個陽性對照組(絲裂霉素C2.0mg/kg體重),每組10只。樣品以灌胃方式給予,連續(xù)5天,每天1次,對照組也相同處理。于首次灌胃后第35天脫臼處死,每組隨機選5只小鼠分別取兩側(cè)附睪,制成吸濾液直接涂片,自然干燥,甲醇固定,用1%伊紅染色。
3.5 觀察指標(biāo) 高倍鏡下觀察精子形態(tài)并計數(shù),每只小鼠計數(shù)完整精子1000條,計算精子畸形發(fā)生率(%)。
4 實驗結(jié)果
4.1 大鼠急性經(jīng)口毒性試驗 實驗期間,各組大鼠均未見明顯癥狀,也無死亡。三葉青對雌雄大鼠經(jīng)口LD50均大于100g/kg體重,屬實際無毒。
4.2 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗 實驗期間,各組小鼠均未見明顯癥狀,也無死亡。三葉青對雌雄大鼠經(jīng)口LD50均大于40.0g/kg體重,屬實際無毒。
4.3 Ames試驗 各菌株回變菌落數(shù)見表1。表1 三葉青Ames平扳摻入試驗結(jié)果(略)從實驗結(jié)果可見,不同濃度受試物在加和不加S 9 條件下的回變菌落與陰性對照組相近似,而陽性對照回變菌落數(shù)均高于陰性對照回變菌落數(shù)2倍以上。說明三葉青 Ames試驗檢測結(jié)果為陰性。
4.4 小鼠骨髓細胞微核試驗 三葉青對小鼠骨髓細胞微核率的影響見表2。表2 三葉青對小鼠骨髓細胞微核率的影響(略)注: * P<0.01(與陰性對照組比較)
用卡方檢驗統(tǒng)計,雌雄各劑量組與陰性對照組比較,微核千分率均無顯著性差異,而陽性對照組微核率則顯著高于陰性對照組,其差異有顯著性(P<0.01)。說明三葉青 對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率未見明顯影響。
4.5 小鼠精子畸形試驗 三葉青對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響見表3。表3 三葉青對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響(略)注: * P<0.01(與陰性對照組比較)各劑量組與陰性對照組比較,小鼠精子畸形發(fā)生率均無顯著性差異,而陽性對照組則明顯高于陰性對照組,其差異有顯著性意義(P<0.01)。說明三葉青對小鼠精子畸形發(fā)生率未見明顯影響。
5 結(jié)論
三葉青按《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版) 中“食品安全性毒理學(xué)評價試驗:第一階段大鼠經(jīng)口急性毒性半數(shù)致死LD50),雌雄兩性別均大于100g/kg體重:小鼠經(jīng)口急性毒性半數(shù)致死量(LD50),雌雄兩性別均大于40.0g/kg體重,按急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)判定,屬實際無毒;第二階段Ames試驗結(jié)果為陰性,小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗結(jié)果均為陰性,說明三葉青未顯示有致突變性。
作者單位:
1 310013浙江杭州,浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院
2 浙江杭州,武警浙江總隊機關(guān)門診部
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