低氧條件下大鼠視網(wǎng)膜葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白的表達

【摘要】  目的 研究低氧條件下葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(grp78)在大鼠視網(wǎng)膜中的表達情況,探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在視網(wǎng)膜低氧條件下的作用及其機制。方法 Wistar大鼠30只,隨機分為正常對照組和實驗組,正常對照組飼養(yǎng)于常氧環(huán)境中,實驗組飼養(yǎng)于低氧倉。實驗組又按照在低氧倉飼養(yǎng)時間分為6、12、24、48和72 h等5個亞組,并于這5個時間點處死大鼠,摘除眼球,應(yīng)用免疫組織化學方法和RT?PCR法測定各組大鼠grp78蛋白表達。結(jié)果 grp78在正常大鼠視網(wǎng)膜中少量表達,低氧條件下6 h開始升高,24 h到達高峰,72 h降至正常水平。低氧條件下6、12、24、48 h表達量與正常對照組比較差異有顯著性(F=32.22,q=5.32～11.53,P＜0.05);72 h 視網(wǎng)膜grp78的表達與正常對照組相比,差異無顯著性(q=2.79,P >0.05)。結(jié)論 低氧條件下grp78在大鼠視網(wǎng)膜中表達,它參與了大鼠視網(wǎng)膜低氧損傷的發(fā)生機制。 
【關(guān)鍵詞】  葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白;視網(wǎng)膜;缺氧;大鼠,Wistar
　�。跘BSTRACT］ Objective To investigate the expression of glucose regulated protein (grp78) under hypoxia and to study the effect and mechanism of endoplasmic reticulum stress.  Methods Thirty wistar rats were randomly divided into normal control group and experimental group. The rats in the experimental group were killed after hypoxia breeding for 6, 12, 24, 48 and72 hours, respectively; the eyeballs were then removed. The expression of grp78 was studied immunohistochemically and by using reverse transcriptase PCR (RT?PCR). Results Expression of  grp78 was weak in normal retina, but increased after 6 hours of hypoxia, reached its peak after 24 hours of hypoxia and fell back to the normal level after 72 hours. The differences in expressions of grp78 in the rats after hypoxia breeding for 6, 12, 24 and 48 hours were significant, compared with that of control group (F=32.22;q=5.32-11.53;P<0.05). The difference between breeding of 72 h group and the control group was not significant (q=2.79,P>0.05). Conclusion grp78 is strongly expressed in rat retina under hypoxia and involves in the mechanism of retinal hypoxic injury.
    ［KEY WORDS］ glucose regulated protein; retinal; anoxia; rats, Wistar
    低氧使細胞的生理功能發(fā)生改變， 造成全身組織和器官失灌而損傷。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是指在缺血、低氧或氧化應(yīng)激等各種因素使細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)生理功能紊亂時,細胞啟動的自我保護反應(yīng)機制,它有利于細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)和維持細胞存活[1]。近年來對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與全身多種疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系研究較多。視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜而且代謝旺盛,對低氧等刺激敏感,本實驗觀察大鼠視網(wǎng)膜低氧不同時間內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志物——葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(grp78)在視網(wǎng)膜組織中的表達變化，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在大鼠低氧條件下的作用。
　　1  材料和方法
　　1.1  實驗材料
    成年Wistar 大鼠30 只，雌雄不限,體質(zhì)量為220～250 g，由青島大學醫(yī)學院實驗動物中心提供， 室溫飼養(yǎng)。兔抗鼠grp78 多克隆抗體(美國Stressgen公司),免疫組織化學Biotin SP2HRP Kit(北京中杉公司),Trizol(Invitrogen公司),M2MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶、rTaq 酶(Takara 公司), 引物設(shè)計合成由大連寶生物公司完成。
　　1.2  低氧模型的建立及實驗分組
    用有機玻璃（厚度4 cm）制成低氧倉，體積為100 cm×60 cm×60 cm，三氯甲烷封側(cè)面，倉體上面開一直徑1 cm的出氣孔，側(cè)面開一直徑1 cm的進氣孔，通過三通管分別接氮氣和壓縮空氣。用玻璃轉(zhuǎn)子流量計（沈陽市北量流量儀器廠）控制流量。Wistar大鼠30只，隨機分為正常對照組（n=5）和實驗組（n=25），正常對照組飼養(yǎng)于常氧環(huán)境中，實驗組飼養(yǎng)于氧體積分數(shù)為0.05的低氧倉。實驗組又按照在低氧倉飼養(yǎng)時間分為6、12、24、48和72 h等5個亞組，并于這5個時間點處死大鼠(每次5只)，摘除眼球。常規(guī)方法制備組織石蠟標本。分別用免疫組織化學染色方法和RT?PCR法測定grp78的表達。
　　1.3  免疫組織化學染色
    石蠟切片常規(guī)脫蠟復(fù)水，按照免疫組織化學試劑盒說明行SP法染色,陰性對照采用PBS代替一抗。顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織中g(shù)rp78的表達情況,染色陽性反應(yīng)物質(zhì)表現(xiàn)為棕黃色顆粒,每組標本取5張切片,每張切片取5個視野,數(shù)碼照相機采集圖像,用Image?pro?plus 6.0圖像分析軟件測定細胞平均吸光度(A)值。
　　1.4  逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(yīng)(RT?PCR)
　　1.4.1  總RNA提取 
　　大鼠處死后立即摘除眼球,沿角鞏膜緣撕除角膜,小心撥除晶狀體和玻璃體,完整分離視網(wǎng)膜組織,研磨后加入1 mL的trizol,提取總RNA,紫外線分光光度計測定RNA含量。
　　1.4.2  RT反應(yīng) 
　　按照試劑盒說明書進行。
　　1.4.3  PCR反應(yīng) 
　　grp78引物序列為:上游5′?AGCCCACCGTAACAAT2CAAG?3′,下游5′?TCCAGCCATTCGATCTTTTC?3′,預(yù)計擴增片段長度445 bp,β?actin用作內(nèi)參照(片段長度265 bp)，引物合成參照文獻[2]方法。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min; 95 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,共30個循環(huán);最后72 ℃再延伸10 min。取5 μL PCR產(chǎn)物,以12 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離目的基因片段,溴化乙錠染色,紫外線燈下觀察并攝片,經(jīng)圖像分析系統(tǒng)測定A值,應(yīng)用半定量法進行g(shù)rp78 mRNA定量測定,以基因產(chǎn)物A值和內(nèi)參照A值比表示。
　　1.5  統(tǒng)計學處理
    采用 SPSS 11.5和PPMS 1.5[3]統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理,結(jié)果以±s表示,數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析及SNK?q檢驗。
　　2  結(jié) 果
　　2.1  各組視網(wǎng)膜中g(shù)rp78表達的比較
    對照組大鼠視網(wǎng)膜組織grp78弱陽性表達,主要分布于視網(wǎng)膜節(jié)細胞層和內(nèi)核層。低氧條件 6 h grp78的表達開始升高,仍表達在視網(wǎng)膜節(jié)細胞層和內(nèi)核層，與對照組相比差異有顯著性(q=5.32,P<0.05);12 h即可見grp78表達明顯增多(q=9.37,P<0.01);grp78的表達高峰出現(xiàn)在24 h(q=15.14,P<0.01);48 h grp78表達開始下降,但仍高于正常對照組(q=11.53,P<0.01)；72 h組grp78的表達與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(q=2.80,P>0.05)。 見表1。
　　2.2  RT?PCR檢測
    grp78 mRNA與內(nèi)參照GAPDH mRNA的擴增產(chǎn)物片段長度分別為445、265 bp，與預(yù)期相符。內(nèi)參照基因擴增產(chǎn)物均明顯可見，各組視網(wǎng)膜組織grp78 mRNA的RT?PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。半定量分析的結(jié)果顯示,對照組大鼠視網(wǎng)膜組織中g(shù)rp78 mRNA有少量表達。低氧12 h即可見grp78 mRNA表達明顯增多（F=183.61，q=7.83,P<0.01）；grp78 mRNA的表達高峰出現(xiàn)在24 h(q=32.33,P<0.01）；48 h grp78 mRNA表達開始下降，但仍高于對照組(q=23.48,P<0.01）；72 h grp78 mRNA的表達與正常對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義(q=0.34,P>0.05）。見表1。表1  各組視網(wǎng)膜中g(shù)rp78及grp78 mRNA表達的比較（略）　
　　3  討 論
    視網(wǎng)膜是高度分化的神經(jīng)組織，中樞神經(jīng)系統(tǒng)對低氧最敏感，在人體的感官系統(tǒng)中，視網(wǎng)膜的代謝非常旺盛，主要由有氧代謝提供能量，對低氧的耐受性最低，機體內(nèi)血氧的濃度及其彌散入組織的水平對維持視網(wǎng)膜組織的正常生理功能起著重要的作用。大量的研究表明，低氧對視網(wǎng)膜的神經(jīng)元損傷，尤其是神經(jīng)節(jié)細胞的損傷明顯[4]。早在1988年,DAVID發(fā)現(xiàn)處于低氧環(huán)境中的雞胚胎視網(wǎng)膜內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)狀層及神經(jīng)節(jié)細胞層受損。低氧24 h可導致視網(wǎng)膜所有類型的細胞數(shù)明顯下降[5]。

    有研究表明，低氧導致的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞損傷與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)是細胞的一種自我保護性機制,以恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài),維持生存。但是過強或長時間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可以引起細胞凋亡。一些損傷因素如低氧、 葡萄糖或氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)不足,肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中折疊受阻,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中分泌蛋白超負荷、病毒感染、 基因突變、 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與胞質(zhì)間鈣離子濃度差失調(diào)等都可成為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要誘因[6]。細胞為了生存產(chǎn)生針對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的反應(yīng),稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。grp78又名免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(bip)，被認為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的標志性分子，其生理狀態(tài)下表達很低，主要功能是作為分子伴侶參與新生多肽鏈的折疊、裝配和轉(zhuǎn)運；在缺血、低氧、低糖、氧化應(yīng)激、鈣離子失衡等不利環(huán)境應(yīng)激下引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，導致大量多肽鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)變性、積聚，此時grp78的表達量顯著增高，一方面協(xié)助變性蛋白進行重新折疊、裝配及跨膜轉(zhuǎn)運，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力；另一方面將無法恢復(fù)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移給蛋白降解系統(tǒng)降解，從而避免細胞進一步受到傷害，它提高了細胞在應(yīng)激情況下的生存能力和促進應(yīng)激后的細胞康復(fù)[7]。
    一些眼底疾病如糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞(缺血型)、視網(wǎng)膜中央動脈阻塞等, 可導致視網(wǎng)膜組織低氧[8]。在理論上，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)參與了視網(wǎng)膜低氧性病變的發(fā)病機制。本實驗構(gòu)建視網(wǎng)膜低氧模型，觀察大鼠低氧條件下不同時間段grp78的表達變化。結(jié)果顯示,在正常視網(wǎng)膜組織中g(shù)rp78少量表達,主要分布在 RGC層和內(nèi)核層,低氧條件下6 h grp78 mRNA和蛋白表達均升高,24 h表達升高達到高峰,48 h后表達有所下降。表明低氧條件生存24 h時內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自穩(wěn)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用達到最佳水平,低氧條件生存后48 h grp78的表達下降可能與低氧細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)恢復(fù)有關(guān),也可能是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自穩(wěn)系統(tǒng)遭到了破壞,不能通過增加grp78的表達來結(jié)束內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài),細胞啟動了凋亡通路。本研究結(jié)果提示，grp78的動態(tài)表達可能與低氧導致的視網(wǎng)膜損傷的進展密切相關(guān),同時也提示了一種通過誘導內(nèi)源性grp78生成來延緩低氧導致的視網(wǎng)膜損傷發(fā)展的新思路。低氧導致的視網(wǎng)膜損傷的發(fā)病機制是多因素、多途徑的結(jié)果,若早期在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激環(huán)節(jié)上加以干預(yù),有可能為延緩低氧導致的視網(wǎng)膜損傷的發(fā)展提供新的治療途徑。
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