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大劑量維生素C對(duì)外周血細(xì)胞活性的影響
作者：薛美蘭 張秀珍 馬愛(ài)國(guó) 姜秀波 張金玉
【摘要】 目的 觀察大劑量維生素C（VC）對(duì)外周血淋巴細(xì)胞增殖活性、抗DNA氧化損傷能力以及紅細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響。方法 將48只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、A、B、C共4組，分別給予含VC為0、2 000、5 000、10 000 mg/kg的飼料，實(shí)驗(yàn)期為8周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后無(wú)痛處死動(dòng)物并取血，測(cè)定血漿VC、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量，紅細(xì)胞膜谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH?Px）活性、紅細(xì)胞膜流動(dòng)性、淋巴細(xì)胞增殖活性，單細(xì)胞凝膠電泳計(jì)數(shù)彗星細(xì)胞測(cè)量DNA氧化損傷水平。結(jié)果 與對(duì)照組比較，A組血漿SOD活性明顯增高（F=2.987,q=4.24，P<0.05），血漿MDA含量明顯降低(F=4.176,q=4.23，P<0.05)，紅細(xì)胞膜流動(dòng)性和外周血淋巴細(xì)胞增殖活性均明顯增高（F=2.278～2.763,q=3.67-3.84，P<0.05）；C組的血漿VC含量明顯升高（F=3.235,q=4.63，P<0.01），SOD和紅細(xì)胞膜GSH?Px活性明顯降低（F=2.987、3.478,q=3.68～4.13，P均<0.05），MDA含量明顯增高（q=4.08，P<0.05）。10 μmol/L H2O2誘發(fā)DNA損傷B組和C組較對(duì)照組均加重（F=4.137,q=3.94、4.25，P<0.05）。結(jié)論 較高劑量VC（2 000 mg/kg）可明顯增高大鼠機(jī)體的抗氧化損傷水平，改善紅細(xì)胞膜流動(dòng)性，提高淋巴細(xì)胞的增殖活性；當(dāng)VC劑量超過(guò)5 000 mg/kg時(shí)，反而會(huì)加重淋巴細(xì)胞的DNA氧化損傷。
【關(guān)鍵詞】 抗壞血酸；超氧化物歧化酶；膜流動(dòng)性；淋巴細(xì)胞活化；DNA損傷
維生素C（VC）是一種水溶性維生素，具有抗氧化活性。一般認(rèn)為VC是水溶性的，不能在體內(nèi)蓄積，攝入較高劑量不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害。已知超大劑量服用VC會(huì)產(chǎn)生副作用，包括胃脹氣、腹瀉、嘔吐等。有一項(xiàng)體外研究指出，VC抗氧化作用與其劑量有密切關(guān)系[1]，過(guò)大劑量的VC（0.5 mmol/L）可能增加細(xì)胞DNA對(duì)H2O2或其他有害物質(zhì)損害的敏感性。目前，健康機(jī)體攝入高劑量的VC是否有不良影響尚無(wú)定論。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行超出生理需要量數(shù)倍的大劑量VC干預(yù)，觀察大劑量VC對(duì)健康幼年大鼠外周血淋巴細(xì)胞增殖活性和抗DNA氧化損傷能力以及紅細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響及其可能機(jī)制。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。
1 材料與方法
1.1 動(dòng)物分組及處理
幼年Wistar大鼠48只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，體質(zhì)量80～100 g，由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供�；A(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、A、B、C共4組，每組12只，分別給予含VC為0、2 000、5 000、10 000 mg/kg的飼料（在基礎(chǔ)飼料中添加VC并充分混勻，低溫壓制并經(jīng)循環(huán)風(fēng)自然干燥，飼料制成后立即放入-20 ℃冰箱中保存）。各組動(dòng)物自由飲水，環(huán)境溫度維持在23～25 ℃。實(shí)驗(yàn)期為8周�；A(chǔ)飼料的成分組成（%）：面粉20，玉米粉30，豆面15，麩皮25，魚(yú)粉5，骨粉1，食鹽1，酵母粉1，色拉油2，核黃素0.004，魚(yú)肝油0.04。
1.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法
1.2.1 血樣采集 大鼠處死前12 h撤掉食物，應(yīng)用200 g/L的烏拉坦麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血，留取800 μL紅細(xì)胞，按低滲一步溶血法[2]制備紅細(xì)胞膜備用，并同時(shí)分離淋巴細(xì)胞。其余全血離心獲取血漿置于-20 ℃冰箱中保存待測(cè)。
1.2.2 血漿VC測(cè)定 采用2，4?二硝基苯肼法。
1.2.3 血漿超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量以及紅細(xì)胞膜谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH?Px）活性測(cè)定SOD活性測(cè)定采用羥胺法，GSH?Px活性測(cè)定采用DTNB直接法，MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法。SOD、GSH?Px、MDA試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。
1.2.4 紅細(xì)胞膜流動(dòng)性測(cè)定 采用Lowry法測(cè)蛋白，調(diào)整膜蛋白的濃度為200～800 mg/L, DPH熒光標(biāo)記紅細(xì)胞膜。應(yīng)用美國(guó)PE公司LS?50型熒光分光光度計(jì)測(cè)熒光偏振度，Ex 362 nm，Em 432 nm，狹縫10 nm，溫度25 ℃，按文獻(xiàn)[4]公式計(jì)算熒光偏振度P值和微黏滯度η值。
1.2.5 外周血淋巴細(xì)胞增殖活性的測(cè)定 采用ELX 2800酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法測(cè)定。
1.2.6 DNA氧化損傷分析 采用單細(xì)胞凝膠電泳或彗星電泳技術(shù)檢測(cè)[3]，取新鮮抗凝血30 μL，經(jīng)分離獲取淋巴細(xì)胞，分別應(yīng)用0、10、25 μmol/L的H2O2氧化處理5 min。將DAPI熒光染色的細(xì)胞核在熒光顯微鏡下觀察100個(gè)“彗星”細(xì)胞，根據(jù)拖尾的長(zhǎng)度衡量DNA鏈斷裂損傷程度（AU）[4]。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
采用SPSS 11.0和PPMS 1.5[5]統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析。
2 結(jié)果
2.1 各組血漿VC、SOD、MDA含量和紅細(xì)胞膜GSH?Px活性比較
與對(duì)照組比較，A組血漿SOD活性升高（F=2.987,q=4.24，P<0.05），MDA含量顯著下降（F=4.176,q=4.23，P<0.05）；C組的血漿VC含量明顯升高（F=3.235,q=4.63，P<0.01），SOD活性明顯下降（q=4.13，P<0.05），MDA含量明顯升高（q=4.08，P<0.05），紅細(xì)胞膜GSH?Px 活性明顯下降（F=3.475,q=3.68，P<0.05）。與A組比較，B組和C組MDA含量明顯升高（q=4.73～5.20，P<0.01），SOD活性明顯下降（q=3.58～3.65，P<0.05）；C組的血漿VC含量明顯升高（q=4.51，P<0.01），紅細(xì)胞膜GSH?Px 活性明顯下降（q=3.84，P<0.05）。 見(jiàn)表1。
表1 各組血漿VC、SOD、MDA含量和紅細(xì)胞膜GSH?Px活性比較（略）
與對(duì)照組比較，F(xiàn)=2.987～4.176，*q=3.68～4.63，P<0.05；與A組比較，#q=3.58～5.20，P<0.05
2.2 各組大鼠淋巴細(xì)胞增殖活性的比較
對(duì)照組淋巴細(xì)胞增殖活性為0.042±0.036，A組為0.111±0.115，B組為0.049±0.059，C組為0.041±0.047。與對(duì)照組比較，A組的外周血淋巴細(xì)胞增殖活性明顯升高（F=2.278，q=3.67，P<0.05）；與A組比較，C組的淋巴細(xì)胞增殖活性明顯降低（q=4.19，P<0.05）。
2.3 各組大鼠紅細(xì)胞膜流動(dòng)性的比較
與對(duì)照組比較，A組紅細(xì)胞膜P、η值顯著升高（F=2.458、2.763，q=3.84、4.23，P<0.05）；與A組比較，C組紅細(xì)胞膜P、η值顯著下降（q=4.61、6.54，P<0.01）。見(jiàn)表2。
2.4 各組大鼠淋巴細(xì)胞DNA氧化損傷的比較
與對(duì)照組比較，A、B、C各組大鼠0、5 μmol/L的H2O2誘發(fā)的DNA氧化損傷的差異均無(wú)顯著性（F=0.485、0.250，P>0.05）。B組和C組大鼠10 μmol/L的H2O2誘發(fā)的DNA氧化損傷增高,差異有顯著性（F=4.137，q=3.94、4.25，P<0.05）。
見(jiàn)表3。
表2 VC對(duì)紅細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響（略）
與對(duì)照組比較，F(xiàn)=2.458、2.763，*q=3.84、4.23；與A組比較，#q=4.61、6.54，P<0.01
表3 各組大鼠淋巴細(xì)胞DNA氧化損傷情況比較（略）
與對(duì)照組比較，F(xiàn)=4.137，*q=3.94、4.25，P<0.05
3 討論
VC為一種六碳糖酸的烯二醇內(nèi)酯，易溶于水，為水溶性維生素，人體攝入生理量的VC之后，在消化道幾乎被全部吸收，其吸收的比例隨攝入VC量的增加而下降。一般認(rèn)為，VC是水溶性的，不能在體內(nèi)蓄積。本文結(jié)果顯示， 10 000 mg/kg劑量組血漿VC含量明顯高于對(duì)照組和2 000 mg/kg劑量組，提示攝入大劑量的VC超過(guò)了機(jī)體的代償能力，腎小管不能完全排除過(guò)量的VC，最終導(dǎo)致血漿VC水平上升。
但是，補(bǔ)充過(guò)高劑量VC(超過(guò)5 000 mg/kg)引起血漿SOD活性降低，MDA含量升高，紅細(xì)胞膜GSH?Px活性明顯下降，對(duì)紅細(xì)胞膜流動(dòng)性、淋巴細(xì)胞的增殖活性沒(méi)有明顯的保護(hù)作用，甚至在H2O2誘導(dǎo)損傷時(shí)，反而造成淋巴細(xì)胞DNA損傷加重。SELMAN 等[6]研究顯示，長(zhǎng)期大量補(bǔ)充VC對(duì)小鼠的壽命和氧化應(yīng)激損傷沒(méi)有影響，反而會(huì)減少內(nèi)源性抗氧化劑基因的表達(dá)。有研究指出，VC在一定條件下具有促氧化劑作用，健康人膳食中補(bǔ)充大劑量VC（500 mg/d）可產(chǎn)生促氧化劑活性，而給大鼠大劑量VC可顯著增高單氧酶活性，并使O-2的活性上升，繼而可能導(dǎo)致DNA損傷[7]。HININGER等[8]研究顯示，應(yīng)用含大劑量VC（5 g）的EDTA螯合療法治療糖尿病或心血管疾病時(shí)，會(huì)產(chǎn)生明顯的促氧化效應(yīng)，導(dǎo)致紅細(xì)胞SOD、GSH?Px等抗氧化酶活性下降。因此，當(dāng)補(bǔ)充VC劑量過(guò)大時(shí)，引起血漿中VC的蓄積，VC可能發(fā)揮其促氧化作用，使自由基生成增加，激發(fā)了體內(nèi)過(guò)氧化反應(yīng)，體內(nèi)活性氧濃度升高造成細(xì)胞氧化損傷，影響細(xì)胞功能，導(dǎo)致細(xì)胞增殖活性下降。
COOKE等[9]對(duì)健康人每天補(bǔ)充VC 500 mg，血中和尿中DNA氧化損傷產(chǎn)物8?OH?dG水平下降，VC水平升高，且二者之間呈較強(qiáng)的相關(guān)性。ANDERSON等[10]將人外周血淋巴細(xì)胞（含血清）與不同劑量的VC共同作用0.5 h，結(jié)果顯示，VC有促進(jìn)DNA鏈斷裂的作用，且有劑量?反應(yīng)關(guān)系。VC可破壞DNA的堿基和脫氧核糖，使DNA鏈降解。補(bǔ)充較大劑量的VC時(shí)，由于VC可能具有增加帶有著絲粒和非著絲粒微核形成的傾向，可作為前氧化物損傷著絲�；蚣忓N絲蛋白或作為一種紡錘絲斷裂劑造成DNA損傷的微核率增加[11]，從而促進(jìn)DNA的誘導(dǎo)損傷。提示補(bǔ)充大劑量VC 加重DNA損傷。
綜上所述，健康機(jī)體攝入適宜劑量的VC即可以滿足抗氧化損傷的需要，維持細(xì)胞功能活性的穩(wěn)定。過(guò)量補(bǔ)充VC對(duì)健康機(jī)體紅細(xì)胞膜流動(dòng)性和外周血淋巴細(xì)胞沒(méi)有保護(hù)作用，反而會(huì)使機(jī)體抗氧化損傷能力下降。其作用機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。
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