人參皂苷Rg1激活PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)6?OHDA毒性作用的影響

【摘要】  目的 探討人參皂苷Rg1對(duì)抗6?羥基多巴胺(6?OHDA)毒性作用的信號(hào)通路。方法 MES23.5細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，免疫印跡法觀察人參皂苷Rg1預(yù)處理對(duì)6?OHDA誘導(dǎo)的磷酸化蛋白激酶B (Akt) 表達(dá)的影響，MTT法觀察細(xì)胞的存活率。結(jié)果 6?OHDA可時(shí)間依賴性地降低MES23.5細(xì)胞磷酸化Akt的表達(dá)(F=24.51,P<0.01)，人參皂苷Rg1預(yù)處理可明顯增強(qiáng)磷酸化Akt的表達(dá)(t=471.60,P<0.01);人參皂苷Rg1預(yù)處理可明顯降低6?OHDA對(duì)MES23.5細(xì)胞的損傷作用，此作用可以被磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特異性抑制劑LY294002所阻斷(F=25.12,P<0.01)。結(jié)論 人參皂苷Rg1通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)抗6?OHDA對(duì)MES23.5神經(jīng)細(xì)胞的毒性作用。 
【關(guān)鍵詞】  人參皂甙;羥多巴胺;毒性作用;蛋白激酶B;神經(jīng)元
[ABSTRACT] Objective To study the signaling pathway involved in the protective effect of ginsenoside Rg1 against 6?OHDA?induced toxicity. Methods MES23.5 cells were routinely cultured and the effect of ginsenoside Rg1 against the 6?OHDA induced Akt phosphorylation was detected by western blot method, and the cell survival observed by MTT method. Results 6?OHDA inhibited the Akt phosphorylation in a time?dependent manner in MES23.5 cells (F=24.51,P<0.01). Pretreatment with ginsenoside Rg1 could increase the Akt phosphorylation (F=12.37,P<0.01). Pretreatment with ginsenoside Rg1 could decrease the 6?OHDA?induced toxicity in MES23.5 cells and these effects could be completely blocked by the PI3K inhibitor LY294002 (t=471.60,P<0.01). Conclusion Ginsenoside Rg1 protects against 6?OHDA?induced neurotoxicity via the activation of the PI3K/Akt signaling pathway in MES23.5 cells.
　　[KEY WORDS] Ginsenoside; Oxidopamine; Toxic actions; Casein kinase B; Neurons
　　帕金森病(PD)是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要的病理改變是中腦黑質(zhì)致密帶(SNzc)多巴胺(DA)能神經(jīng)元功能障礙[1,2]。PD的病因迄今未明，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，研究認(rèn)為可能與氧化應(yīng)激、興奮性毒素、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡等機(jī)制密切相關(guān)。目前對(duì)PD的治療手段不斷發(fā)展，可分為藥物治療、基因治療和外科治療等，但藥物治療長(zhǎng)期應(yīng)用后的副作用、外科手術(shù)治療的昂貴及遠(yuǎn)期療效的不確定性，使得各國(guó)學(xué)者試圖從不同的角度入手，探尋新的治療方法。人參皂苷是人參的主要活性成分，包含有30多種人參單體，如Rg1、Rg2、Rb1、Rb2、Rc等，Rg1在人參皂苷中的含量豐富。近年來(lái)的研究顯示，人參皂苷Rg1具有多種生物活性[3,4]，特別是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，Rg1具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用。本研究室的前期實(shí)驗(yàn)已揭示Rg1可以對(duì)抗6?OHDA對(duì)MES23.5神經(jīng)元的損傷[5]，為了進(jìn)一步探討人參皂苷Rg1對(duì)抗6?OHDA毒性作用的機(jī)制，本研究應(yīng)用6?OHDA損傷MES23.5神經(jīng)細(xì)胞，建立PD細(xì)胞模型，并應(yīng)用人參皂苷Rg1進(jìn)行干預(yù)，從細(xì)胞和分子水平探討6?OHDA誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的信號(hào)途徑以及Rg1的保護(hù)效應(yīng)，以期為人參皂苷Rg1的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　1 材料與方法
　　1.1 試劑及其來(lái)源
　　純度為99.9%人參皂苷Rg1購(gòu)自白求恩醫(yī)科大學(xué);DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司(美國(guó));6?OHDA購(gòu)自Sigma公司(美國(guó));抗Akt抗體購(gòu)自Santa Cruz公司(美國(guó));抗磷酸化Akt抗體購(gòu)自購(gòu)自Cell signaling公司(美國(guó));LY294002購(gòu)自Tocrics公司(美國(guó));ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Promega公司(美國(guó));噻唑藍(lán)(MTT)和胎牛血清均購(gòu)自Gibco BRL公司。MES23.5細(xì)胞由樂(lè)衛(wèi)東教授提供(美國(guó)貝勒醫(yī)學(xué)院)。
　　1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理
　　MES23.5細(xì)胞接種于96孔板或6孔板，用含體積分?jǐn)?shù)0.05牛血清及Sato成分的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí)，分別用在有或無(wú)LY294002 (10 μmol/L)存在的情況下，應(yīng)用Rg1(10-8mol/L)預(yù)保護(hù)24 h,然后再給予6?OHDA(100 μmol/L)，共分為對(duì)照組、6?OHDA組、Rg1+6?OHDA組及Rg1+LY294002+6?OHDA組。
　　1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)
　　將傳代細(xì)胞接種于96孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)量為3×103個(gè)。當(dāng)細(xì)胞均勻貼壁生長(zhǎng)時(shí)，在有或者無(wú)LY294002共存情況下，先用10-8mol/L的Rg1預(yù)保護(hù)細(xì)胞24 h，再用6?OHDA處理，24 h后去除培養(yǎng)液，加5 g/L的MTT 20 μL，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔中加DMSO 100 μL，混勻后用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)570 nm處的吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞存活率。
　　1.4 免疫印跡法檢測(cè)pAkt和Akt蛋白的表達(dá)
　　將傳代細(xì)胞接種于6孔板中，6?OHDA組用6?OHDA(100 μmol/L)處理細(xì)胞0.5、1、2、4、6 h。Rg1預(yù)保護(hù)組先用10-8mol/L的Rg1預(yù)保護(hù)細(xì)胞24 h，再用6?OHDA處理細(xì)胞0.5、1、2、4、6 h，去掉培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，沉淀細(xì)胞。去掉上清液，用含蛋白酶抑制劑(2 mg/L aprotinin,2 mg/L leupeptin, 1 mmol/L phenylmethylsulfonylfluoride)和磷酸酶抑制劑(1 mmol/L sodium orthovanadate,10 mmol/L NaF)Nonidet P?40(20 mmol/L Tris?HCl, pH 7.5;150 mmol/L NaCl;1 mmol/L CaCl2;1 mmol/L MgCl2; 體積分?jǐn)?shù)0.10 的glycerol; 體積分?jǐn)?shù)0.01的Nonidet P?40)溶液裂解細(xì)胞。應(yīng)用Bradford試劑測(cè)定蛋白濃度，取20 μg的蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5 min，在100 g/L SDS?PAGE凝膠上電泳，然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。以體積分?jǐn)?shù)0.05脫脂奶粉室溫封閉2 h后與抗pAkt(1∶1 000)或抗Akt(1∶2 000)一抗4 ℃孵育過(guò)夜，繼以羊抗兔IgG?HRP二抗孵育2 h，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行檢測(cè)，用pAkt/Akt的灰度比值代表Akt的磷酸化活性。
　　1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　本文結(jié)果的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用Graph Pad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One?Way ANOV)，以Tukey法進(jìn)行兩兩比較。
　　2 結(jié) 果
　　2.1 人參皂苷Rg1對(duì)抗6?OHDA對(duì)MES23.5神經(jīng)元損傷的作用
　　6?OHDA組細(xì)胞存活率為0.732±0.060，與對(duì)照組(1.000±0.075)相比，細(xì)胞存活率下降26.8%，差異有顯著性(F=25.12,q=7.604,P<0.01)。應(yīng)用10-8mol/L Rg1預(yù)處理細(xì)胞24 h，可明顯對(duì)抗6?OHDA的毒性作用，細(xì)胞存活率為0.900±0.044，較6?OHDA組升高23.0%，差異有極顯著性(q=4.768，P<0.05)。MES23.5細(xì)胞經(jīng)人參皂苷Rg1和LY294002預(yù)處理24 h后，再與6?OHDA共同作用24 h，結(jié)果顯示細(xì)胞的存活率為0.602±0.062，與6?OHDA組比較無(wú)顯著差異。說(shuō)明PI3K特異性抑制劑LY294002可以完全阻斷Rg1對(duì)MES23.5細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　2.2 6?OHDA對(duì)MES23.5細(xì)胞pAkt表達(dá)的影響及Rg1的保護(hù)作用
　　MES23.5細(xì)胞經(jīng)100 μmol/L的6?OHDA處理0.5、1、2、4、6 h后，6?OHDA可以時(shí)間依賴性地降低pAkt的表達(dá)(F=24.51，P<0.01),Rg1+6?OHDA組pAkt表達(dá)明顯增強(qiáng),在0.5 h差異有顯著性(t=471.60，P<0.01)。提示Rg1可通過(guò)增強(qiáng)PI3K/Akt信號(hào)通路的活性，對(duì)抗6?OHDA的毒性作用。見(jiàn)表1。表1 Rg1預(yù)處理對(duì)6?OHDA誘導(dǎo)的MES23.5細(xì)胞pAkt表達(dá)的影響
　　3 討 論
　　人參皂苷Rg1是人參的主要活性成分，藥理學(xué)研究表明，Rg1具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力和增強(qiáng)記憶力等作用。近年來(lái)的研究顯示，人參皂苷Rg1具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)作用，Rg1能夠?qū)�抗MPTP對(duì)小鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺神經(jīng)元的損傷，其機(jī)制與抗凋亡和抗氧化應(yīng)激有關(guān)。本研究室的前期工作已證實(shí)Rg1對(duì)神經(jīng)毒素6?OHDA誘導(dǎo)的大鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)多巴胺能神經(jīng)元的損傷具有明顯的保護(hù)作用[4]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)，Rg1可以對(duì)抗6?OHDA對(duì)雜交瘤性多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞系MES23.5細(xì)胞的損傷[5]。為了進(jìn)一步探討人參皂苷Rg1神經(jīng)保護(hù)作用的信號(hào)通路，本研究應(yīng)用6?OHDA誘導(dǎo)MES23.5神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，觀察6?OHDA對(duì)細(xì)胞存活率及磷酸化Akt表達(dá)的影響及人參皂苷Rg1的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，6?OHDA對(duì)MES23.5細(xì)胞具有明顯的毒性作用，可以降低細(xì)胞的存活率。6?OHDA可以時(shí)間依賴性地降低磷酸化Akt的表達(dá)，應(yīng)用人參皂苷Rg1可以明顯對(duì)抗6?OHDA的毒性作用，提高pAkt的表達(dá)，應(yīng)用PI3K特異性抑制劑LY294002進(jìn)一步揭示Rg1的神經(jīng)保護(hù)作用與PI3K/Akt信號(hào)通路的激活有關(guān)。

PI3K/Akt是胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅰ受體(IGF?ⅠR)信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要的信號(hào)分子，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化、抑制細(xì)胞凋亡及促進(jìn)骨架蛋白重排的作用[6,7]。PI3K被激活后，即可通過(guò)磷酸化激活其下游信號(hào)蛋白Akt，激活的Akt可以直接磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Bcl?2和NF?B，從而促進(jìn)細(xì)胞的存活[8,9]。6?OHDA作為一種神經(jīng)毒素，可以直接抑制線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物，導(dǎo)致ATP耗竭細(xì)胞變性死亡;也可通過(guò)單胺氧化酶B生成過(guò)氧化氫，再由Fe2+經(jīng)Fenton反應(yīng)生成羥自由基，造成DA能神經(jīng)元變性、凋亡[10]。在前期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1可刺激雌激素受體(ER)陽(yáng)性的乳癌細(xì)胞MCF?7增生并可增強(qiáng)雌激素反應(yīng)元件的活性，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)揭示Rg1不直接與ER結(jié)合，但可以明顯增加MCF?7細(xì)胞內(nèi)IGF?ⅠR的表達(dá)及IGF?ⅠR啟動(dòng)子的活性，且此作用可以被IGF?ⅠR拮抗劑JB?1所阻斷[11]。上述結(jié)果表明，Rg1作用機(jī)制與IGF?ⅠR信號(hào)途徑有關(guān)。為了探討6?OHDA神經(jīng)毒性作用及Rg1神經(jīng)保護(hù)作用的信號(hào)通路，本研究觀察了6?OHDA對(duì)MES23.5細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，結(jié)果顯示應(yīng)用6?OHDA處理細(xì)胞自4 h開(kāi)始，Akt的活性較對(duì)照組明顯降低，提示6?OHDA通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路活性發(fā)揮其毒性作用。而人參皂苷Rg1預(yù)處理組pAkt表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，提示Rg1可能通過(guò)增強(qiáng)PI3K/Akt信號(hào)通路的活性對(duì)抗6?OHDA的毒性作用。為進(jìn)一步證實(shí)人參皂苷Rg1的神經(jīng)保護(hù)作用與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)，本研究應(yīng)用PI3K特異性抑制劑LY294002，觀察其對(duì)Rg1神經(jīng)保護(hù)作用的影響，結(jié)果顯示，LY294002可以完全阻斷Rg1對(duì)MES23.5細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　綜上所述，人參皂苷Rg1可明顯對(duì)抗6?OHDA對(duì)MES23.5細(xì)胞的毒性作用，其作用機(jī)制與PI3K/Akt信號(hào)通路的激活有關(guān)。
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