大腸桿菌表達人IL?21融合蛋白的純化和抗原性分析
作者：付強 錢冬萌 閆志勇 侯偉 王斌
【摘要】 目的 在大腸桿菌中表達人IL?21編碼基因，并進行蛋白純化和抗原性分析。方法 以經PHA刺激的人扁桃體細胞cDNA 文庫為模板，經PCR獲得IL?21全基因片段。測序確認后，分別設計含BamHⅠ和SalⅠ酶切位點的引物，經PCR獲得IL?21成熟肽的編碼基因。將此IL?21基因插入表達載體pGEX?4T?2，重組克隆經酶切與測序確認后轉化大腸桿菌DH5α,進行IPTG誘導表達。經瓊脂糖珠結合的純化方法所得產物用Western Blotting作抗原性分析。結果 SDS?PAGE顯示經IPTG誘導后的大腸桿菌DH5α表達與理論相符的條帶，并獲得了與理論值相符的純化條帶，在進一步的Western Blotting分析中發(fā)現(xiàn)表達的蛋白能與IL?2的單抗產生結合反應。結論 人IL?21編碼基因克隆載體在大腸桿菌中成功表達，同時建立了該蛋白的瓊脂糖珠純化方法，通過免疫印跡實驗揭示了原核表達的IL?21蛋白與IL?2之間結構的相似性。
【關鍵詞】 白細胞介素21; 基因表達;免疫印跡法；重組融合蛋白質類
�。跘BSTRACT］ObjectiveTo express coding gene of human interleukin?21 (IL?21) in E.coli, purify its protein, and assay its antigenicity.MethodsHuman IL?21 gene fragments were obtained from human tonsil cDNA by PCR. The coding gene for the mature N terminus of IL?21 was inserted into prokaryotic expressing vector pGEX?4T?2 and transformed into E.coli DH5α. The expressed product was purified by affinity chromatography using GST Fusion Protein Purification bead and its antigenicity analyzed by Western Blotting.ResultsInduced by IPTG, E.coli DH5α expressed the right molecular weight protein. Western Blotting test showed the protein had reaction with IL?2 monoclonal antibody.ConclusionThe vector pGEX?4T?2/IL?21 and engineering bacteria E.coli DH5α expressing IL?21 mature N terminus fusion protein is successfully constructed. By purification and Western Blotting test, the recombinant IL?21 revealed resemblant antigenicity to IL?2.
［KEY WORDS］Interleukin?21; Gene expression; Immunoblotting; Recombinant fusion proteins
以美國JULIA教授為首的研究小組在國際上首次構建了BaF3/IL?21R細胞系，并用此細胞系從活化的CD+3細胞中分離并鑒定了一類新的細胞因子——人白細胞介素21（IL?21）[1]，此后世界范圍多個實驗室相繼進行了相關研究。現(xiàn)在已知IL?21具有廣泛的生物學功能，能夠調節(jié)體液和細胞介導的免疫應答，刺激T、B和NK細胞的增殖、活化和分化，并且對腫瘤細胞的生長有抑制作用[2～4]。本研究構建了中國人IL?21基因編碼的重組質粒，并在大腸桿菌中進行表達[5]。同時通過進一步對表達產物進行GST親和層析純化后，使用IL?2單克隆抗體與重組蛋白做Western Blotting抗原性分析�，F(xiàn)將結果報告如下。
1 材料和方法
1.1 質粒、菌株和主要試劑
質粒pGEX4T?2和菌株E.coli JM109、E.coli DH5α均為本室保存。PCR試劑、T4 DNA連接酶、PCR產物純化試劑盒、pGEM?T Easy Vector 試劑盒均購自Promega公司。DNA限制性內切酶BamH Ⅰ、Sal Ⅰ 均購自Takara公司。引物均由北京賽百盛公司合成(PAGE純化)，GST Fusion Protein Purification bead 購自Amersham公司。
1.2 IL?21全編碼基因的克隆
將經PHA刺激培養(yǎng)48 h的人扁桃體細胞總RNA逆轉錄為cDNA后，進行PCR擴增。利用T4 DNA連接酶將7.5 μL PCR純化產物與0.5 μL T?Easy載體連接。同時，使用TSS法制備感受態(tài)大腸桿菌JM109，將連接產物轉化后在涂有X?Gal和IPTG的ALB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng),37 ℃放置12～16 h。 通過藍白斑法選擇陰性、陽性克隆，從中提取重組質粒DNA，采用 PCR和酶切初步鑒定后，進行DNA序列測定分析。
1.3 IL?21重組表達質粒的構建
利用含BamHⅠ和SalⅠ酶切位點的引物，經PCR獲得IL?21成熟肽的編碼基因。經過純化的PCR產物及載體pGEX4T?2同時用核酸內切酶BamHⅠ和SalⅠ消化后以T4連接酶連接，構建原核重組表達質粒。對用TSS法新鮮制備的感受態(tài)E.Coli.DH5α進行轉化。對轉化長出的菌落進行質粒小提，用限制性內切酶進行初步鑒定后，進行DNA序列測定分析。
1.4 重組質粒在大腸桿菌中的誘導表達
挑取單個重組成功菌落接種于5 mL Amp?LB中, 37 ℃震蕩培養(yǎng),當菌液吸光度達到0.4～0.6時,用終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導目的基因在大腸桿菌DH5菌中的表達。分別于誘導后1、2、4 h取菌液3 mL，12 000 r/min離心1 min，沉淀用SDS凝膠加樣緩沖液震蕩后置沸水浴5 min，稍微離心，上清移至新管,-20 ℃儲存?zhèn)溆�。同時，用DH5α宿主菌和未誘導的含重組質粒的DH5α菌，以及誘導的含pGEX4T?2質粒的DH5α菌樣品作對照行SDS?PAGE。
1.5 表達蛋白的純化和Western Blotting分析
根據(jù)37 ℃時蛋白表達情況，降低細菌的誘導溫度到23 ℃進行大體積低溫誘導3 h。收集菌液，經離心后，將菌斑用適當體積的PBS液洗滌兩次后再次重懸，冰浴下超聲裂解細菌。4 ℃，14 000 r/min離心10 min分離上清。將上清中加入GST Fusion Protein Purification bead震蕩30 min純化濃縮上清中的蛋白。將誘導的菌體、純化的融合蛋白進行SDS?PAGE電泳，電泳后用Bio?Rad公司的電轉儀將蛋白轉至PVDF膜上。電轉結束后將膜在麗春紅染液中染色，用鉛筆標記出蛋白Marker。然后，參照分子克隆實驗操作。一抗為IL?2的單克隆抗體，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG。
2 結 果
2.1 目的基因的PCR擴增
PCR擴增的IL?21全編碼基因長為642 bp，其中成熟N端編碼基因長為396 bp。同DNA標準相對分子質量參照物相比，PCR擴增產物的大小與預測的結果一致（圖1）。
2.2 原核重組表達質粒的鑒定
經PCR擴增出的IL?21成熟肽的編碼基因片段和鑒定重組成功的質粒經雙酶切后同時進行電泳，可見酶切產物和PCR擴增條帶大小與理論
值相符（圖2）。
2.3 表達蛋白的SDS?PAGE
經SDS?PAGE，考馬斯亮藍R?250染色觀察，含重組質粒的誘導菌在相對分子質量為41 000位置出現(xiàn)一蛋白條帶，而未誘導的重組質粒轉化菌在相應位置沒有蛋白條帶；含質粒pGEX4T?2的誘導菌在相對分子質量為26 000位置出現(xiàn)一條帶。目的基因表達的多肽相對分子質量估計為15 000，與融合蛋白共同表達相對分子質量約為41 000的多肽，與理論估計相一致。經凝膠成像掃描，融合蛋白產量占總蛋白的10%（圖3）。
2.4 表達蛋白的純化
大體積蛋白表達后，將細菌裂解液上清和純化濃縮的蛋白進行電泳分析，結果顯示得到理想的純化融合蛋白條帶(圖4)。
將純化的融合蛋白進行SDS?PAGE，電泳后作Western Blotting分析，結果可見有與理論相符的條帶（圖 5）。
3 討 論
人IL?21是IL?2家族中的新成員，主要由活化的CD+4 T細胞產生，與IL?2、IL?15、IL?4等細胞因子具有高度同源性。其基因定位于4q26?27, 距離IL?2 基因約180 kb。結構分析表明，成熟的人IL?21 含有四螺旋族細胞因子結構域,該結構域與IL?2、IL?4、IL?15 的四螺旋族細胞因子結構域有較高的同源性。IL?21 與IL?15 在相同的位置有兩對相同的半胱氨酸, 其中一對在IL?2、IL?4中具有保守性。最近通過核磁共振技術獲得的高精三維結構表明，人IL?21有不同的同工異構體，并在細胞實驗中呈現(xiàn)十分不同的活性[6]。
本實驗從活化扁桃體細胞中克隆出人IL?21的cDNA并進行序列測定，同時構建了中國人IL?21表達克隆，并在DH5α宿主菌中表達出與谷胱甘肽轉移酶融合的蛋白。采用瓊脂糖珠結合的純化方法，獲得了與理論值相符合的純化條帶。在進一步的Western Blotting分析中顯示，該種條件下表達的融合蛋白能與IL?2的單抗產生結合反應。這一實驗結果結合人IL?21最新的結構分析和體外活性實驗，進一步證實了人IL?21在臨床與IL?2聯(lián)用或單獨使用具有的調節(jié)免疫功能和抗腫瘤活性[2,7]，并為進一步檢測人IL?21的各種體內外活性奠定了理論和實驗的基礎。
【參考文獻】
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