atRA對動脈內皮損傷后平滑肌細胞CDKs表達影響

【摘要】  目的 探討全反式維甲酸（atRA）對受損大鼠主動脈內皮平滑肌細胞周期素依賴性激酶(CDKs)表達的影響。方法 77只大鼠隨機分為假手術組、損傷組、atRA組，分別于術后2、7、14 d取實驗動脈段，測定內膜、中膜平滑肌細胞CDK2、CDK4的表達水平。結果 損傷組CDK2、CDK4均于術后2 d在中膜表達，隨后表達漸少，損傷后7 d，在內膜有表達，14 d內膜表達呈強陽性，并可見向管腔表面聚集現象；atRA組CDK2陽性表達指數較損傷組顯著下降(t=4.97～17.86，P<0.01),CDK4陽性表達指數亦顯著下降(t=5.64～20.05，P<0.01)。結論atRA可能通過抑制CDK2、CDK4的過表達而抑制細胞周期進程，從而抑制內膜增生。 
【關鍵詞】  維甲酸 創(chuàng)傷和損傷 動脈 肌細胞 平滑肌 細胞周期蛋白質依賴激酶類
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effects of all?trans retinoic acid (atRA) on the expression of cyclin?dependent kinase （CDKs） after vascular injury. MethodsThe rats were randomly divided into sham operated group, injury group, and atRA group. The aortic tissues were taken on day 2, 7, and 14, respectively. Immunohistochemistry for CDK2 and CDK4 was performed at different times. Results Immunohistochemical analysis revealed expression of both CDK2 and CDK4 within the media of injured thoracic arteries at day 2. At day 7, expression of CDK2 and CDK4 declined to basal levels in the media but both were detected within the intimal lesion. By day 14, when a prominent intimal lesion formed, CDK2 and CDK4 were largely confined to the luminal surface. Less CDK2 (t=4.97-17.86，P＜0.01) and less CDK4 (t=5.64-20.05，P＜0.01) immunostaining were found in the atRA group than in the control group.ConclusionAtRA may inhibit the VSMC cell cycle by reducing the over?expression of CDK2 and CDK4 to inhibit intimal hyperplasia.
    ［KEY WORDS］tretinoin； wounds and injuries； arteries； myocytes, smooth muscle； cyclin?dependent kinases
    經皮冠狀動脈介入治療（PCI）術后，由于動脈壁損傷及炎性反應，刺激諸多細胞因子、生長因子產生，導致血管平滑肌細胞（VSMC）增生并向內膜遷移，支架內再狹窄率可達15%～20%左右，影響PCI術后遠期療效。刺激VSMC增生的分子機制和信號傳導途徑是呈網絡狀分布的，僅抑制某一種因子并不能有效抑制VSMC增生，尋求VSMC增生最后的共同途徑，才是有效抑制VSMC增生的最佳途徑，細胞周期可能就是這樣一種最終的共同的途徑。全反式維甲酸（atRA）具有影響細胞生長、凋亡、分化與移行等廣泛的生物學作用,因此亦可能對某些血管疾病有治療價值。本文通過分析atRA對球囊損傷大鼠胸主動脈后平滑肌細胞的細胞周期素依賴性激酶(CDKs)表達的影響，探討atRA用于防治PCI術后再狹窄的機制。
    1  材料與方法
    1.1  材料
    atRA為上海第六制藥廠產品；CDK2單克隆抗體（工作液）為美國Santa Cruz公司產品；CDK4單克隆抗體（工作液）、免疫組化通用SP試劑盒為美國ZYMED公司產品；VIDAS 21圖像分析系統(tǒng)為德國蔡氏公司產品；自制2F球囊導管。Wistar大鼠購自北京大學心血管病基礎研究所。
    1.2  方法
    1.2.1  動物分組  77只健康雄性Wistar大鼠，體質量350～450 g（均于術前4 d至處死給予植物油灌胃），隨機分為3組。假手術組（n=11）：除不插入球囊導管外，余操作均同損傷組，術后14 d處死；損傷組：按球囊損傷術后處死時間又分為術后2、7、14 d等3個亞組，每個亞組11只；atRA組：亦分為術后2、7、14 d等3個亞組，每個亞組11只，術前4 d至處死給予atRA（30 mg·kg-1·d-1）灌胃。
    1.2.2  動物模型制作  參照劉乃奎等［1］的方法，將大鼠用6 g/L戊巴比妥鈉（5 mL/kg腹腔內注射）麻醉后，經左頸總動脈插入2F球囊導管至腹主動脈處，注入0.1 mL生理鹽水擴張球囊，回拉至頸總動脈分叉處，反復3次，將導管旋轉180°，再反復回拉3次，拔出導管，結扎縫合切口，常規(guī)飼養(yǎng)。術前1 d及術后3 d每只大鼠給予青霉素10萬單位腹腔內注射預防感染。
    1.2.3  標本制備  將大鼠處死后，快速摘取胸主動脈，連續(xù)剪取3段2.5 mm長的血管，去除外膜內疏松結締組織，置于中性甲醛緩沖液固定24 h，經石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，每段血管標本取3張切片，采用SP法，嚴格按照試劑盒操作步驟分別進行CDK2、CDK4免疫組化染色。光鏡下觀察免疫組化切片，胞核呈棕色為陽性。每只大鼠每個指標觀察9張切片，VIDAS 21圖像分析系統(tǒng)隨機測量每張切片中10個視野(400倍)陽性細胞的平均吸光度及平均陽性細胞百分率，取其均數，用兩者乘積再乘以100作為陽性表達指數，來表示蛋白質的表達水平。
    1.2.4  統(tǒng)計學分析  數據以±s表示，采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件分析。組間比較采用t檢驗。
    2  結    果
    假手術組CDK2、CDK4表達均呈陰性反應。損傷組CDK2、CDK4均于術后2 d在中膜散在陽性表達；術后7 d，CDK2、CDK4在新生內膜呈陽性表達，中膜則少或無表達；術后14 d，CDK2、CDK4隨內膜進一步增厚均呈強陽性表達，且有向管腔表面聚集的趨勢。atRA組與損傷組比較，中膜（2、7 d）或內膜（7、14 d）CDK2的陽性表達均明顯減少(t=4.97～17.86,P<0.01)；CDK4的陽性表達亦均明顯減少（t=5.64～20.05,P<0.01）。見表1。表1  atRA對球囊損傷大鼠胸主動脈內皮后平滑肌細胞CDKs陽性表達指數的影響與損傷組相應時間比較，*t=4.97～17.86,P<0.01；△t=5.64～20.05,P<0.01
    3  討    論  
　  血管內皮損傷后，VSMC向內膜的遷移、增生是再狹窄的主要病理機制［2,3］。抑制平滑肌細胞增生和向內膜遷移是預防血管成形術后再狹窄的重要手段。
    CDKs是一種蛋白激酶家族，是細胞周期調節(jié)重要分子，它們通過磷酸化?脫磷酸化調節(jié)一系列靶分子的活性，最終導致DNA的復制和有絲分裂。研究發(fā)現，atRA能維持并誘導VSMC處于較高水平的分化狀態(tài)，抑制VSMC遷移和增殖［4］。CDK?cyclin復合物的周期性聚集、激活和解聚可驅動細胞周期運轉，CDK是復合物的催化亞基，而cyclin是調節(jié)亞基。cyclinE?CDK2、cyclinA?CDK2和cyclinD?CDK4共同參與G1期和S期的視網膜母細胞瘤基因(Rb)磷酸化，使E2F釋放，增加轉錄RNA的速度，促進細胞由G1期向S期過渡［5］。KOSOKA等［6］采用細胞培養(yǎng)研究發(fā)現,atRA對cyclinE、cyclinD3、CDK4、CDK6、CDK2等多種基因有抑制作用，從而抑制細胞周期進程。劉國霞等［7］應用免疫組化和電子顯微鏡觀察的方法研究atRA對原代培養(yǎng)的人腹主動脈VSMC增殖的影響，發(fā)現atRA使VSMC的增長速度減慢，經atRA處理的細胞中cyclinD1、CDK4的表達分別降低了39%和38%，c?myc基因的表達水平降低了43.6%。

    本實驗結果顯示，CDK2、CDK4在正常動脈壁血管組織中表達量甚微或無；球囊損傷術后2 d其均呈陽性反應，陽性細胞在中膜散在表達；術后7 d新生內膜形成，均在內膜表達，中膜則少或無表達；術后14 d隨內膜進一步增厚，表達局限于內膜，均呈強陽性，且有向管腔表面聚集的趨勢，這與WEI等［8］的報道相一致。其變化規(guī)律與形態(tài)學表現相一致，說明CDK2、CDK4的表達是對球囊損傷的一種反應，CDK2、CDK4的過度表達及其對細胞周期的影響是發(fā)生再狹窄的機制之一。atRA使中膜（2、7 d）和內膜（7、14 d）的CDK2、CDK4陽性表達均明顯少于損傷組，說明atRA可能通過抑制G1期CDK2、CDK4的表達而影響CDK4與cyclinD的結合，影響CDK2與cyclinD、cyclinE在晚G1和早S期的結合，從而抑制G1→S期進程；通過抑制S期CDK2的表達，影響CDK2與cyclinA在S期的結合，從而抑制DNA的合成。
    CDK2可作為血管成形術后再狹窄防治中的靶基因［8］。MORISHITA等［9］合成了CDK2的反義寡核苷酸，以病毒HVU?脂質體為介導，轉染到大鼠損傷頸動脈，轉染2周即發(fā)現內膜增生被顯著抑制（抑制率達60%）。SUZUKI等［10］亦證實HVJ?脂質體介導的CDK2反義寡核苷酸對移植冠狀動脈內膜增生有抑制作用。TAKAGI［11］發(fā)現，腺病毒誘導的CDK抑制物p57kip2的過度表達可抑制血管平滑肌細胞的增殖，且VSMC大部分停留在G1期，亦提示CDKs可作為血管成形術后再狹窄防治中的靶基因。
    然而，單獨針對細胞周期調節(jié)因子的治療可能并不能治療人類復雜的血管栓塞性疾病，仍需從不同的角度進一步研究、探討維甲酸對PCI術后再狹窄的防治作用及其機制。
 
【參考文獻】
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［3］ HUNGERFORD J E, LITTLE C D. Developmental biology of the vascular smooth muscle cell: building a multilayered vessel wall［J］. J Vasc Res, 1999,36:2．

［4］ 褚現明，鐘志歡，王國棟，等. 全反式維甲酸對球囊損傷大鼠胸主動脈VSMC表型變化及增殖的影響［J］. 青島大學醫(yī)學院學報， 2005，41（4）：297.

［5］ 徐松德，張建業(yè)． 醫(yī)用分子生物學［M］. 北京：人民衛(wèi)生出版社， 1999：205．

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［7］ 劉國霞，李存璽，曾靈芳，等． 維甲酸對人腹主動脈平滑肌細胞增殖的影響［J］. 科學通報， 1998,43(21)：2286．

［8］ WEI G L, KRASIKI K, KEARNEY M, et al. Temperally and spatially coordinated expression of cell cycle regulatory factors after angioplasty ［J］. Circ Res, 1997,80(3):418.

［9］ MORISHITA R, GIBBONS G H, ELLISON K E, et al. Intimal hyperplasia after vascular injury is inhibited by antisense kinase oligonucleotides ［J］. J Clin Invest, 1994,93:1458.

［10］ SUZUKI J, ISOBE M, MORISHITA R, et al. Prevention of graft coronary arteriosclerosis by antisense CDK2 kinase oligonucleotide ［J］. Nature Medicine, 1997,3:900.

［11］ TAKAGI Y. Adenovirus?mediated overexpression of a cyclin?dependent kinase inhibitor, p57kip2, suppressed vascular smooth muscle cell proliferation ［J］. Hokkaido Igaku Zasshi, 2002,77(3):221.

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