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雙氟胞苷對兔晶狀體上皮細胞體外生長的抑制作用
作者：于海濤 王亞玲 楊青 閻洪祿
【摘要】 目的探討雙氟胞苷對培養(yǎng)的兔晶狀體上皮細胞(RLECs)體外生長的抑制作用，為臨床防治后發(fā)性白內(nèi)障提供理論依據(jù)。方法在第3代體外培養(yǎng)RLECs中加入不同濃度雙氟胞苷，采用MTT比色法及血細胞板計數(shù)法觀察不同濃度的雙氟胞苷對體外培養(yǎng)的RLECs增殖的抑制作用。結(jié)果濃度為64 mg/L雙氟胞苷在24 h對RLECs無明顯的抑制作用;濃度為128~4 096 mg/L的雙氟胞苷在24、48、72 h對RLECs有明顯的抑制作用，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=22.248~34.090，q=2.188~11.353，P<0.05)。在同一作用時間隨雙氟胞苷濃度的增高，對RLECs的抑制作用逐漸增強，各濃度之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(q=2.122~10.524，P<0.05)。各實驗濃度的雙氟胞苷對RLECs的抑制作用隨作用時間延長逐漸增強，在72 h抑制作用最強。MTT比色法結(jié)果與血細胞板計數(shù)法結(jié)果一致。結(jié)論雙氟胞苷可抑制體外培養(yǎng)RLECs的增殖，可用于抑制、預(yù)防后發(fā)性白內(nèi)障的形成。
【關(guān)鍵詞】 雙氟胞苷;晶體;上皮細胞;細胞培養(yǎng)技術(shù);兔
[ABSTRACT]ObjectiveTo study the depressant effect of Gemcitabine on the cells of rabbit epithelium lentis (REL) in vitro, and provide a theoretical evidence for treatment of aftercataract.MethodsThe cells of REL were cultured in vitro, and different concentrations of Gemcitabine were added into the cells of the third generation. The effect of Gemcitabine at different concentrations on the cells was measured with MTT staining colorimetry and cell count technique.ResultsThe Gemcitabine at the concentration of 64 mg/L for 24 h did not show inhibition on cells of REL (P>0.05); at 128-4 096 mg/L for 24 h, 48 h, and72 h showed obvious inhibition (F=22.248-34.090,q=2.188-11.353,P<0.05), the differences were significant as compared with the control. Under the same-time condition, the inhibitory action increased with the increase of the concentration of Gemci-tabine, the differences among different concentrations were significant (q=2.122-10.524,P<0.05). With the same concentration, the effect of prohibition depended on time. The result of MTT was consistent to that of cell count technique.ConclusionGemcitabine depresses the growth of REL cells cultured in vitro, which can be used to inhibit and prevent secondary cataract.
[KEY WORDS]gemcitabine; lens, crystalline; epithelial cell; cell culture technique; rabbits
后發(fā)性白內(nèi)障是白內(nèi)障囊外摘除術(shù)后常見的并發(fā)癥,也是影響病人術(shù)后視力的最主要原因之一，其術(shù)后1、3、5年的白內(nèi)障發(fā)生率在成人可以高達11.8%、20.7%、28.5%[1-2]。有關(guān)實驗的結(jié)果表明，術(shù)后殘留的晶狀體上皮細胞的增殖和遷移，轉(zhuǎn)化為成纖維細胞，可能是形成后發(fā)性白內(nèi)障的主要原因之一[3-4]。本實驗旨在觀察雙氟胞苷對培養(yǎng)的兔晶狀體上皮細胞(RLECs)體外生長的抑制作用，為臨床防治后發(fā)性白內(nèi)障提供理論依據(jù)。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1實驗動物取實驗用家兔10只，體質(zhì)量為1.5～2.5 kg，雌雄不限，由青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。
1.1.2主要試劑與藥品DMEM干粉培養(yǎng)基(GIBCO BRL 公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，胰蛋白酶(GIBCO BRL 公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma 公司)，雙氟胞苷(美國禮萊亞洲公司)，青霉素鈉(華北制藥有限公司)，硫酸鏈霉素和硫酸慶大霉素(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)。
1.2方法
1.2.1培養(yǎng)液的配制將DMEM干粉培養(yǎng)基加入1 000 mL三蒸水配制成DMEM培養(yǎng)液，加入滅活的小牛血清,使之成為含體積分數(shù)0.150小牛血清的培養(yǎng)液，4 ℃冰箱保存。MTT溶液: 將MTT474用PBS液溶解，濃度為5 mg/L,兩層微孔濾膜過濾除菌，4 ℃避光保存。
1.2.2RLECs的培養(yǎng)實驗用兔空氣栓塞致死后，完整摘除眼球，在超凈工作臺內(nèi)取出晶狀體，分離出連著晶狀體赤道部的前囊膜。將晶狀體前囊膜剪成組織碎片，均勻鋪貼于培養(yǎng)瓶底壁，加入培養(yǎng)液置于培養(yǎng)箱中，至細胞游出相互融合，然后進行傳代培養(yǎng)。取培養(yǎng)的第3代RLECs，制成細胞懸液，用血細胞板觀察四角大方格的細胞數(shù)[5-7]。
1.2.3實驗分組根據(jù)條件培養(yǎng)液的不同，隨機分為8組，陰性對照組(無血清培養(yǎng)液)和濃度為64、128、256、512、1 024、2 048、4 096 mg/L的雙氟胞苷無血清培養(yǎng)液組。
1.2.4RLECs計數(shù)①血細胞板計數(shù)法[8]：將RLECs懸液調(diào)整到細胞密度為2.5×107/L，平行接種到24孔培養(yǎng)板上，每孔1 mL，平行3個，放入CO2培養(yǎng)箱中10 h后取出，棄上清液，8組分別加入條件培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h，觀察細胞形態(tài)學(xué)改變。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后棄去條件培養(yǎng)液，加胰酶消化后，每孔加D-Hanks液1 mL，將細胞吹打均勻，用血細胞板計數(shù)，每孔計數(shù)8次，取平均值。②MTT比色法[9-11]：將RLECs懸液調(diào)整到細胞密度為5×107/L。平行接種于96孔培養(yǎng)板，平行3個，每板分為9組，每組6孔，第1組為200 μL不含細胞的空白對照組，其余8組分別加入200 μL上述密度的細胞培養(yǎng)液(含體積分數(shù)0.150小牛血清)，每孔細胞數(shù)約為5×103個，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。10 h后，分別將含有細胞的8組培養(yǎng)液棄去，按實驗分組加入條件培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24、48、72 h后棄去上清液，每孔再加20 μL濃度為5 g/L的MTT液，3 h后終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)200 μL，在震蕩器上震蕩30 min，使結(jié)晶物充分溶解，在全自動酶聯(lián)免疫檢測儀上測定570 nm波長處的吸光度(A)值。結(jié)果以MTT比色法測定值減去空白對照組測定值表示。
1.2.5統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用SPSS 12.0及PPMS 1.5[12]軟件處理，組間比較采用方差分析。
2結(jié)果
2.1正常培養(yǎng)的RLECs形態(tài)學(xué)觀察
組織碎片在接種24~48 h后可見細胞游走出植片邊緣，貼壁生長，細胞逐漸增多，隨時間延長細胞密度增大，最初在靠近植片處，細胞呈團狀，3~4 d后大部分植片上的細胞游走出植片，圍繞植片生長。6~7 d細胞生長活躍，10 d左右形成圍繞植片的單層上皮細胞，鋪滿瓶底，達到融合狀態(tài)。原代培養(yǎng)的晶狀體上皮細胞呈透明狀，多角形或六邊形，保持上皮細胞的特征。傳代細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，單個細胞為圓形，6 h左右開始貼壁生長，24 h后約80%細胞貼壁，細胞增殖迅速，3~4 d達到融合。2~4代的晶狀體上皮細胞貼壁迅速，增殖快，生長良好，呈展開透明狀，排列不規(guī)則，與原代細胞無明顯差別，傳至6代后，細胞貼壁時間延長，晶狀體上皮細胞變?yōu)槌衫w維細胞形狀，呈長梭形、長條狀，細胞大量增殖，中間出現(xiàn)拉網(wǎng)現(xiàn)象。
2.2雙氟胞苷對RLECs增殖的影響
2.2.1雙氟胞苷對RLECs形態(tài)學(xué)的影響 與陰性對照組比較，濃度為64 mg/L的雙氟胞苷作用于RLECs 24 h后，細胞形態(tài)無明顯差異;濃度為128～4 096 mg/L時，各實驗組的細胞數(shù)量逐漸減少，視野中所見細胞稀疏，細胞體積略小，細胞基質(zhì)較對照組亦減少。隨時間的延長，上述現(xiàn)象更加明顯，實驗組在藥物作用48 h后，細胞數(shù)量進一步減少，細胞收縮呈圓形，細胞基質(zhì)減少;在藥物作用72 h后，各實驗組的細胞數(shù)量及細胞基質(zhì)較24、48 h均明顯減少，在4 096 mg/L組中，視野中偶見小圓形細胞及稀疏的細胞基質(zhì)。
2.2.2血細胞板計數(shù)結(jié)果在24 h 時64 mg/L雙氟胞苷對晶狀體上皮細胞無明顯抑制作用，與陰性對照組比較無顯著意義(P>0.05)。64 mg/L雙氟胞苷在48、72 h時，128～4 096 mg/L雙氟胞苷在24、48、72 h時對晶狀體上皮細胞均有明顯的抑制作用，與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=22.248~34.090，q=2.188~11.353，P<0.05)。在同一作用時間內(nèi)隨雙氟胞苷濃度的增高，對晶狀體上皮細胞的抑制作用逐漸增強，各濃度之間比較差異有顯著性(q=2.122~10.524，P<0.05)。各濃度雙氟胞苷對晶狀體上皮細胞抑制作用，隨時間的延長而逐漸增強，從雙氟胞苷對晶狀體上皮細胞的抑制作用血細胞板計數(shù)結(jié)果曲線來看，在72 h抑制作用最強。見圖1。
2.2.3MTT比色法結(jié)果在24 h 時64 mg/L雙氟胞苷對晶狀體上皮細胞無明顯抑制作用，與陰性對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。64 mg/L雙氟胞苷在48、72 h，128～4 096 mg/L雙氟胞苷在24、48、72 h對晶狀體上皮細胞均有明顯的抑制作 用，與陰性對照組比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=42.435~290.688，q=3.133~37.001，P<0.05)。
3討論
近年來，針對后發(fā)性白內(nèi)障的發(fā)生機制，許多學(xué)者采用多種方法從不同的方向進行研究，尤其是針對抑制殘留晶狀體上皮細胞增殖的藥物研究成為大家關(guān)注的熱點。白內(nèi)障術(shù)后殘留的晶狀體上皮細胞在晶狀體囊膜上的增生、移行、產(chǎn)生膠原，是白內(nèi)障摘除人工晶狀體植入眼發(fā)生后發(fā)性白內(nèi)障的主要原因，晶狀體上皮細胞增生移行至后囊可導(dǎo)致后囊混濁的形成[13-14]。
雙氟胞苷又稱吉西他濱(2，2-二氟脫氧雙氟胞嘧啶核苷)，是一種新的胞嘧啶核苷衍生物，主要代謝產(chǎn)物在細胞內(nèi)參入DNA，主要作用于G1/S期。雙氟胞苷能抑制核苷酸還原酶，導(dǎo)致細胞內(nèi)脫氧核苷三磷酸酯減少，尚能抑制脫氧胞嘧啶脫氨酶減少細胞內(nèi)代謝物的降解，具有自我增效的作用，其對多種腫瘤有效。
本實驗主要采用雙氟胞苷局部用藥的方式，可以減少或消除全身用藥的副作用，另外可以提高藥物局部的濃度，更好地發(fā)揮雙氟胞苷對晶狀體上皮細胞的作用，為今后進一步體內(nèi)應(yīng)用雙氟胞苷打下了理論基礎(chǔ)。
本實驗采用血細胞板計數(shù)法及MTT定量法觀察了雙氟胞苷對晶狀體上皮細胞增殖影響，兩種方法所得實驗結(jié)果基本相同，都顯示了雙氟胞苷在低濃度(64 mg/L)對晶狀體上皮細胞無明顯抑制作用，與陰性對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，隨著雙氟胞苷濃度的增高其抑制晶狀體上皮細胞增殖的作用逐漸增強，在24、48、72 h對晶狀體上皮細胞均有明顯的抑制作用，與陰性對照組比較，差異有顯著性(P<0.05)，說明雙氟胞苷對晶狀體上皮細胞的抑制作用呈劑量依賴性。從MTT比色法A值曲線可以看出，同一濃度雙氟胞苷對晶狀體上皮細胞的抑制作用在72 h作用最強，呈時間依賴性。
綜上所述，雙氟胞苷可抑制體外培養(yǎng)RLECs的增殖，并可因此抑制、預(yù)防后發(fā)性白內(nèi)障的形成。因人晶狀體上皮細胞與RLECs的不同，且體外培養(yǎng)與活體的生理條件有諸多不同，需進一步研究其在人體的作用。雙氟胞苷有望成為預(yù)防后發(fā)性白內(nèi)障的藥物之一。
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