- 相關推薦
IL?18基因多態(tài)性與原發(fā)性干燥綜合征的相關性
作者：李恩澤 辛苗苗 胡彬 閆麗萍 李慧
【摘要】 目的 探討IL?18基因?137G/C、?607C/A位點多態(tài)性及其血清水平與原發(fā)性干燥綜合征的相關性。方法 提取受試者白細胞DNA，采用聚合酶鏈反應?限制性片段長度多態(tài)性技術檢測28例原發(fā)性干燥綜合征病人和52例健康對照者IL?18基因?607C/A、?137G/C位點多態(tài)性，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測兩組血清IL?18含量。結果 兩組IL?18基因?137G/C、?607C/A位點基因型頻率及等位基因頻率比較差異均無顯著性(P>0.05)。原發(fā)性干燥綜合征組血清IL?18水平明顯低于健康對照組，差異有顯著性(t=24.06,P<0.001)。原發(fā)性干燥綜合征組不同基因型間血清IL?18水平比較差異均無顯著性(P>0.05)。結論 血清IL?18水平表達降低可能是原發(fā)性干燥綜合征的促發(fā)因素。
【關鍵詞】 白細胞介素18;基因型;基因頻率;原發(fā)性干燥綜合征
[ABSTRACT] Objective To investigate the association of polymorphisms of ?607C/A, ?137G/C promoters of IL?18 gene and its serum level with primary Sjogren’s syndrome. Methods The DNA of white blood cells were extracted from subjects,polymerase chain reaction?restriction fragment length polymorphism (PCR?RFLP) method was applied to detect polymorphisms of ?607C/A, ?137G/C promoters of IL?18 gene in 28 patients with primary Sjogren’s syndrome (group A) and 52 healthy controls (group B); serum IL?18 was measured in both groups by ELISA. Results There was no differences in IL?18 genotype frequency and allele frequency at position ?607 and ?137 between group A and group B (P>0.05). Serum IL?18 in group A was significantly lower than that in group B, with statistical difference (t=24.06,P<0.001). The differences of serum IL?18 levels between different genotypes in group A did not reach statistical significance (P>0.05). Conclusion Decrease of serum IL?18 is likely to be a precipitating factor of primary Sjogren’s syndrome.
[KEY WORDS] interleukin?18; genotype; gene frequency; Sjogren’s syndrome
原發(fā)性干燥綜合征(PSS)是以口、眼干燥及關節(jié)腫痛為常見表現(xiàn)的一種全身性自身免疫性疾病，常呈現(xiàn)家族聚集性。白細胞介素?18(IL?18)可誘導IFN?γ、IL?2等細胞因子產生，調節(jié)Th1/Th2細胞平衡，有增強免疫、抗腫瘤的作用，并參與某些自身免疫性疾病和變態(tài)反應性疾病的發(fā)生發(fā)展。PSS病人CD4+T細胞水平降低，導致Th1和Th2亞群的分布出現(xiàn)異常，進而引起機體細胞因子網絡調控失常。本文對PSS病人IL?18基因?607C/A、?137G/C位點多態(tài)性以及血清IL?18水平進行檢測，探討其與PSS發(fā)生的相關性。現(xiàn)將結果報告如下。
1 對象與方法
1.1 研究對象
收集我院風濕免疫科就診的PSS病人(PSS組)28例，男1例，女27例，年齡27～84歲，平均為55.96歲，均符合2002年PSS國際分類(診斷)標準提出的診斷標準。另選健康獻血員52例作為對照組，男3例，女49例，年齡22～75歲，平均53.2歲;排除相應疾病家族史。兩組研究對象均無血緣關系，在年齡和性別比例上均無顯著性差異。
1.2 檢測方法
1.2.1 DNA制備 采集受試者空腹靜脈血5 mL至EDTA?K2抗凝管中，顛倒混勻。離心后提取下層血漿和白細胞層約1 mL移入高壓滅菌的離心管中，用酚?氯仿?異戊醇法抽提細胞DNA。將DNA沉淀移入1.5 mL的LEP管中，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀自然干燥后，加無菌純水充分溶解，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/P>
1.2.2 PCR檢測 參考文獻[1]設計擴增 IL?18基因?607位點的特異性引物，2條特異性正向引物序列分別為5′?GTTGCAGAAAGTGTAAAAAT?TATTAC?3′和5′?GTTGCAGAAAGTGTAAAAA?TTATTAA?3′，共同反向引物序列為5′?TAACCT?CATTCAGGACT?3′，質控正向引物序列為5′?CTT?TGCTATCATTCCAG?3′。?137位點2條特異性正向引物序列分別為5′?CCCCAACTTTTACGGA?AGAAAAG?3′和5′?CCCCAACTTTTACGGAAG?AAAAC?3′，共同反向引物序列為5′?AGGAGGGC?AAAATGCACTGG?3′，質控正向引物序列為5′?CCAATAGGACTGATTATTCCGCA?3′。?607位點的PCR總體系為25 μL，包括10×PCR緩沖液2.5 μL(含2.0 mmol/L MgCl2)，0.25 mmol/L 的dNTP，約30 ng基因組DNA和1 U Taq聚合酶。質控正向引物0.4 μmol/L，一種特異性正向引物0.4 μmol/L，共同反向引物0.8 μmol/L。擴增參數(shù)：首先94 ℃預變性4 min;然后94 ℃變性20 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共行7個循環(huán);隨后94 ℃變性20 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共進行35個循環(huán)。取2條特異性正向引物分別擴增的PCR產物于20 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，電壓80 V，40 min，溴化乙錠染色，紫外線凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并鑒定等位基因頻率。?137位點的PCR總體系為25 μL，包括10×PCR緩沖液2.5 μL(含2.0 mmol/L MgCl2)，0.2 mmol/L dNTP，約30 ng基因組DNA和1 U Taq聚合酶。質控正向引物0.5 μmol/L，一種特異性正向引物0.5 μmol/L，共同反向引物1.0 μmol/L。擴增參數(shù)：首先94 ℃預變性2 min;然后94 ℃變性20 s，68 ℃退火60 s，共行5個循環(huán);隨后94 ℃變性20 s，62 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，共進行25個循環(huán)。取2條特異性正向引物分別擴增的PCR產物于20 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，電壓80 V，40 min，溴化乙錠染色，紫外線凝膠成像系統(tǒng)觀察結果并鑒定基因型。
2 結 果
2.1 IL?18基因?607位點多態(tài)性電泳
每份標本分別用2條特異性正向引物做2管PCR，301 bp處為質控條帶，196 bp處是A/C等位基因特異性擴增片段。部分標本?607位點多態(tài)性檢測電泳結果如圖1。標本①只有C等位基因處可觀察到長196 bp特異性擴增片段，所以其基因型為CC;標本②～④的2管PCR產物電泳后均可觀察到長196 bp特異性擴增片段，故其為CA基因型;標本⑤只有A等位基因處可觀察到長196 bp特異性擴增片段，其基因型則為AA。
2.2 IL?18基因?137位點多態(tài)性電泳
圖2為部分標本IL?18基因?137位點多態(tài)性電泳檢測結果，每份標本分別用2條特異性正向引物做2管PCR，446 bp處為質控條帶，261 bp處為G/C等位基因特異性擴增片段。標本②和④只有G等位基因處可觀察到長261 bp特異性擴增片段，所以其基因型為GG;標本③和⑤在兩管PCR產物電泳后均可觀察到長261 bp特異性擴增片段，其基因型為GC;標本①只有C等位基因處可觀察到長度為261 bp特異性擴增片段，其基因型則為CC。
2.3 兩組IL?18基因?137G/C、?607C/A位點基因型頻率和等位基因頻率的比較
兩組IL?18基因?137G/C、?607C/A位點基因型頻率及等位基因頻率比較，差異均無顯著意義(P>0.05)。見表1、2。
2.4 兩組血清IL?18水平的比較
PSS組病人和對照組的血清IL?18水平分別為(49.37±15.77)和(476.79±93.17) ng/L，兩組比較差異有顯著性(t=24.06,P<0.001)。
2.5 IL?18不同基因型病人血清IL?18水平比較
PSS組病人IL?18基因?607位點CC、CA、AA基因型的血清IL?18水平分別為(47.97±13.58)、 (951.41±9.6)、(48.97±9.36)ng/L，IL?18基因?137位點GG、GC、CC基因型的血清IL?18水平則分別為(50.05±9.97)、(48.16±11.60)、(52.80±0.00)ng/L，不同基因型間血清IL?18水平比較差異均無顯著性(P>0.05)。見表2。
表1 IL?18基因?607 C/A位點多態(tài)性分布及其比較(例(χ/%))組別n基因型頻率CCCAAA等位基因頻率CA對照組5213(25.0)28(53.8)11(21.2)54(51.9)50(48.1)PSS組287(25.0)14(50.0)7(25.0)28(50.0)28(50.0)
表2 IL?18基因?137 G/C位點多態(tài)性分布及其比較(例(χ/%))組別n基因型頻率GGGCCC等位基因頻率GC對照組5238(73.1)13(25.0)1(1.9)89(85.6)15(14.4)PSS組2822(78.6)5(17.9)1(3.5)49(87.5)7(12.5)
3 討 論
PSS是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，在多種因素的共同作用下，可導致機體細胞和體液免疫異常，表現(xiàn)為淋巴細胞和漿細胞對靶器官的進行性浸潤，造成靶器官功能障礙。研究表明，PSS病人疾病活動期體內T細胞亞群數(shù)量分布存在明顯異常，表現(xiàn)為CD4+T淋巴細胞水平降低，而CD8+T淋巴細胞水平升高[2?3]。CD4+T淋巴細胞水平降低，導致Th1和Th2亞群的分布出現(xiàn)異常，進而引起機體細胞因子網絡調控失常，如PSS活動期病人體內IFN?γ等細胞因子水平有明顯下降，對疾病的進展影響較大[4]。IL?18屬于IL?1家族成員，它可誘生IFN?γ等細胞因子。INF?γ的生成可促進Th0細胞向Th1細胞分化，從而調節(jié)Th1/Th2細胞平衡，因此認為，IL?18是調節(jié)Th1/Th2細胞因子的重要因子[5]。MATERA等[6]研究表明，IL?18在IL?12誘導新生CD4+T淋巴細胞分化為Th1細胞時起加強作用，在IL?12協(xié)同作用下，IL?18可強烈誘導IFN?γ等Th1型細胞因子的產生，導致組織損傷。本研究結果顯示，PSS病人血清IL?18水平明顯低于對照組，推測PSS病人血清IL?18水平降低可能導致Th1細胞分泌IFN?γ水平下降，Th2細胞分泌IL?4水平相對增高。進一步引起Th1型細胞免疫反應下調而Th2型細胞免疫反應相對增強，Th1/Th2細胞免疫失衡擴大，使機體在多種因素的侵襲下引起免疫反應異常，通過各種細胞因子和炎癥遞質的作用，造成PSS病人組織的損傷。 細胞因子的表達量受基因調控，編碼細胞因子的結構基因轉錄效率下降可導致細胞因子的表達量降低。近年來，對IL?18基因啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性(SNP)與疾病的關系研究有諸多報道，許多研究結果顯示，IL?18 基因多態(tài)性能影響疾病的發(fā)生、發(fā)展[7?9]。IL?18基因?607C/A和?37G/C位點分別存在核因子cAMP反應元件結合蛋白和組蛋白H4轉錄因子結合部位，SIVA等[9]研究認為其多態(tài)性可能影響IL?18的轉錄水平。張平安等[10]采用體外PBMC培養(yǎng)和刺激方法研究IL?18 基因型和表型的關系，結果表明兩個位點的基因多態(tài)性對IL?18分泌和表達無明顯影響。本研究對IL?18基因?607C/A、?137G/C位點多態(tài)性分析結果表明，兩組IL?18基因?607C/A、?137G/C位點基因型頻率和等位基因頻率均無顯著性差異，未得出IL?18基因?607C/A、?137G/C位點多態(tài)性與PSS相關的結論。同時，對不同基因型間的血清IL?18水平進行統(tǒng)計學分析，也未得出基因多態(tài)性可影響IL?18血清水平的結論。由此推斷，IL?18基因?607C/A、?137G/C位點多態(tài)性與某些疾病的易感性有關，并非完全是通過對于其表達量的影響而發(fā)揮作用，可能是該位點與其他相鄰位點存在連鎖失衡的共同結果，也可能與樣本大小、種族差異、地域差異以及遺傳因素和環(huán)境因素之間存在著復雜的相互作用等原因有關。
【參考文獻】
[1]VILMANTASG, BING H, WEN X H, et al. Cloning and mutation analysis of the human IL?18 promotor: a possible role of polymorphisms in expression regulation[J]. J Neuroimmunol, 2001,112:146?152.
[2]VILLARREAL G M, ALCOCER? VARELA J, LLORENTE L. Cytokine gene and CD25 antigen expression by peripheral blood T cells from patients with primary Sjogren’s syndrome[J]. Autoimmunity, 1995,20(4):223.
[3]HU S, TAO D, HE P. Immunophenotyping of lymphocyte T and B in thePeripheral blood of systemic lupus erythematosus[J]. J Tongji Med University, 2001,21(2):108.
[4]KOHRIYAMA K, KATAYAMA Y. Disproportion of helper T cell subsets in peripheral blood of patients with primary Sj?gren’s syndrome[J]. Autoimmunity, 2000,32(1):67?72.
[5]KIMURA K, KAKIMI K, WIELAND S, et al. Interleukin?18 inhibits hepatitis B virus replication in the livers of transgenic mice[J]. Vim I, 2002,76:10702?10707.
[6]MATERA L, MORI M, GEUNA M, et al. Prolactin in autoimmunity and antitumor defence[J]. J Neuroimmunol, 2000,109(1):47?55.
[7]FOLWACZNY M, GLAS J, TOROK H P, et al. Polymorphisms of the interleukin?18 gene in periodontitis patients[J]. J Clin Periodontol, 2005,32(5):530?534.
[8]NOVAK N, KRUSE S, POT RECK J, et al. Single nucleotide polymer?phisms of the IL?18 gene are associated wit hatopic eczema[J]. J Allergy Clin Immunol, 2005,115(4):828?833.
[9]SIVA LINGAM S P, YOON K H, KON D R, et al. Single nucleotide polymorphism region in rheumatoid arthritis patients: protective effect of AA genotype[J]. Tissue Antigens, 2003,62(6):498?504.
[10]張平安,李艷,吳健民. 白細胞介素?18基因多態(tài)性與其表達量關系的研究[J]. 循環(huán)醫(yī)學雜志, 2007,17(1):30?32.
【IL?18基因多態(tài)性與原發(fā)性干燥綜合征的相關性】相關文章：
會計信息相關性概念解讀06-15
基因增強的倫理問題及其價值抉擇探究論文04-26
機械通氣患者發(fā)生ICU綜合征原因分析及對策08-30
不同干燥方法對雞腿菇干制品品質的影響分析08-13
論文的致謝詞（精選18篇）05-26
設計論文致謝（通用18篇）04-21
寫作畢業(yè)論文的體會（精選18篇）05-13