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細胞凋亡與女性生殖研究進展
關(guān)鍵字： 細胞凋亡 生殖細胞凋亡，亦稱程序性死亡，是進化上細胞自殺的保守性程序，它對調(diào)節(jié)細胞自然丟失和組織自身平衡有著重要作用。現(xiàn)已證實，從細菌、無脊椎動物、脊椎動物一直到人，細胞凋亡現(xiàn)象普遍存在。凋亡細胞的典型特征為：染色質(zhì)固縮；基因組脫氧核糖核酸（DNA）降解，形成單個或多個核小體的片斷，在含溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳上呈典型“梯狀”條帶；凋亡小體的形成。凋亡小體和“梯狀”條帶已成為鑒定凋亡細胞的主要實驗手段。最近幾年，對細胞凋亡機制的研究已取得很大進展，本文對女性生殖過程中細胞凋亡的研究作一綜述。
一、卵巢顆粒細胞的凋亡
卵巢為一動態(tài)組織，在每個月經(jīng)周期中許多卵巢開始發(fā)育，但僅一個或兩個卵泡占優(yōu)勢而排卵。在卵泡閉鎖期間，大多數(shù)卵泡死亡，這些生理活動可能與細胞凋亡有關(guān)。有關(guān)卵巢顆粒細胞（ranulosa cells’GCs）凋亡的研究已十分深入。現(xiàn)已證實，多種基因參與了細胞凋亡[1~3]。其中，Bax、p53、WT-1(wilm’s tunor type1)、Fas、Bcl-XShort等基因有促進細胞凋亡的作用，而Bcl-2、Bcl-Xlong等基因起抑制細胞凋亡的作用，且它們的作用皆受促性腺激素中促黃體生成激素（LH）和促卵泡成熟激素（FSH）的調(diào)控。促性腺激素分別通過抑制GCs凋亡。而促性腺激素釋放激素（GnRH）及其激動劑（GnRHa）以及睪酮（T）卻對GCs凋亡起誘導作用。提示人GCs凋亡主要受體液因素的調(diào)節(jié)。
除了基因水平的調(diào)節(jié)外，GCs凋亡的細胞內(nèi)機制可能與caspases凋亡途徑有關(guān)。caspases為一半胱氨酸蛋白酶家族，它對底物中天冬氨酸有特異性，它的活化是底物內(nèi)部天冬氨酸殘基斷裂所必須的。編碼caspases的基因與線蟲遺傳學中定性的凋亡基因具有同源性。已顯示，在小鼠和母牛GCs和黃體細胞中caspase-1和caspase-3表達。最近，Lzawa等[4]用逆轉(zhuǎn)錄多聚合酶鏈反應（RT-PCR）證實了人GCs中caspase-1、caspase-3、凋亡相關(guān)蛋白酶激活因子-1、DNA斷裂因子等基因轉(zhuǎn)錄物的存在，同時用Western印跡證實了caspase-1、caspase-3蛋白前體的存在。體外非細胞系系統(tǒng)研究也提示，凋亡相關(guān)蛋白酶激活因子-1、caspase-3及DNA斷裂因子是一活化的凋亡級聯(lián)反應的組分，其能導致凋亡細胞基因組DNA的特異性降解。人GCs可能也同樣存在著凋亡相關(guān)蛋白本科激活因子-1激活caspase-3，從而依次活化DNA斷裂因子以誘導基因組DNA斷裂的凋亡機制。另外，不同caspases家族成員的存在，也提示GCs中可能存在caspases不同成員之間的連續(xù)活化，如：caspase-9激活caspase-3，再依次激活caspase-6，導致細胞骨架和核纖層降解，從而引起細胞凋亡的機制。
GCs的凋亡亦受類胰島素生長因子（IGF）、類胰島素生長因子結(jié)合蛋白（IGFBP）、IGFBP蛋白酶、激活素（activin）、及γ-干擾素（IFNγ）等協(xié)調(diào)調(diào)控[5]。卵巢膜細胞可產(chǎn)生IGF-I，GCs-II，產(chǎn)生的IGF可成為卵泡液的成分。IGF有促進卵巢細胞有絲分裂和分化的功能，并能抑制GCs凋亡。IGF對卵巢的作用能被IGFBPs家族成員所拮抗，IGFBPs家族共有6個成員，除IGFBP-6外其余5種IGFBPs信使核糖核酸（mRNA）均在黃體化GCs中表達，并產(chǎn)生除IGFBP-5外的所有蛋白。促性腺激素可刺激IGF的產(chǎn)生，降低IGFBP-2和IGFBP-4的水平，從而GCs的凋亡；而IGFBPs的作用與促性腺激素和IGF的作用相反，可促進GCs的凋亡。
有人卵巢的排卵前卵泡和黃體中，淋巴細胞和巨噬細胞可產(chǎn)生IFNγ進入卵泡液中。在培養(yǎng)的GCs中加入IFNγ，GCs中IGFBP-2和IGFBP-4水平明顯增加，GCs凋亡指數(shù)亦上升。GCs亦產(chǎn)生激活素，它是一種二聚體蛋白。激活素A為一種βA亞單位的同源二聚體，它可促進嚙齒動物GCs的凋亡。激活素A加入培養(yǎng)的GCs中，同樣可增加IGFBP-4水平。IFNγ和激活素A增加IGFBP水平時，相應的mRNA水平并無明顯變化，提示它們可能都是通過抑制相應的IGFBP蛋白酶而使IGFBP水平升高的，因為它們皆能抑制類固醇激素，如：雌激素（E）和孕激素（P）的產(chǎn)生，而E的存在可促進IGFBP-4蛋白酶的產(chǎn)生。IFNγ的作用受LH的拮抗，而激活素A的作用不受LH的直接影響，而受LH刺激的GCs產(chǎn)生的卵泡抑素（follistatin）抑制，卵泡抑素能中和活化素結(jié)合蛋白。另外，IFNγ還能誘導Fas抗原表達，而不論在健康還是閉鎖卵泡的卵母細胞上均Fas抗原配體的表達[2]，提示卵母細胞具有誘導表達Fas抗原的GCs凋亡的能力。EGF、BFGF、GH有與IGF類似的作用，但它們是否通過與IGF類似的調(diào)節(jié)機制調(diào)控GCs凋亡，尚待進一步證實。
最近有證據(jù)提示，凋亡細胞內(nèi)部啟動一共同的信號途徑，即通過活化鞘磷脂酶，水解鞘磷脂成酰基鞘氨醇，其作為第二信使依次啟動細胞凋亡。但此過程在GCs中尚未被證實。
排卵前的卵泡GCs可分為兩組，它們的凋亡特征有所不同。一組是卵泡壁GCs，含較高的LH受體，能分泌較高濃度的P，分泌的P對胚植入子宮內(nèi)膜有重要作用。另一組是卵泡卵丘細胞，為GCs的一個亞群，它對卵母細胞的營養(yǎng)和成熟有重要作用，并且可調(diào)節(jié)輸卵管收縮，排卵后，卵丘細胞對維持卵母細胞生存，直至與精子結(jié)合提供環(huán)境。研究證實[6，7]，卵泡壁GCs的凋亡發(fā)生率明顯高于卵丘細胞，這對保持卵母細胞處于健康狀態(tài)是相當合理和重要的。另外，卵泡發(fā)育的不同時期的GCs發(fā)生凋亡的敏感程度亦不同，Johnson等[3]認為，4~8mm的卵泡GCs最易發(fā)生凋亡而致卵泡閉鎖，此期的GCs幾乎檢測不到凋亡抑制基因表達的產(chǎn)物。
除卵泡GCs外，黃體化GCs亦發(fā)生凋亡，它與黃體退化密切相關(guān)[8]。在月經(jīng)周期的14~16d，黃體分泌P，若一個生殖周期內(nèi)未發(fā)生妊娠，則黃體必須退化以保證下一個生殖周期的排卵卵泡的發(fā)育，而黃體退化機制與GCs凋亡機制類似。若發(fā)生妊娠，則P的存在及人絨毛膜促性腺激素（hCG）的分泌可抑制細胞凋亡，從而抑制黃體的退化。妊娠早期的黃體是維持妊娠所必須的。
二、子宮內(nèi)膜細胞的凋亡
在月經(jīng)周期中，子宮內(nèi)膜呈周期性變化，由增生期、分泌期和月經(jīng)期組成。在分泌晚期和月經(jīng)期子宮內(nèi)膜功能層細胞剝脫去除，隨后在增生期基底層細胞又不斷增生補充，而且月經(jīng)期獲得的子宮內(nèi)膜絲狀物中并沒有任何廣泛的壞死物。子宮內(nèi)膜這種周期性變化是否與凋亡有關(guān)，有不少作者進行了研究。Kokawa等[9]用末端標記法和原位雜交技術(shù)檢測了有規(guī)律月經(jīng)周期女性的子宮內(nèi)膜細胞的凋亡情況，在增生早期子宮內(nèi)膜腺細胞有少許低分子量DNA，增生后期及分泌早中期未檢測到低分子量DNA，而分泌晚期的初期又重新出現(xiàn)凋亡子宮內(nèi)膜細胞并迅速擴展到整個功能層，月經(jīng)期殘余的功能層中凋亡細胞含量最高，而在整個月經(jīng)周期中基底層細胞都未顯示凋亡。Tabibzadeh等[11]亦報道，分泌晚期及月經(jīng)期子宮內(nèi)膜功能層細胞凋亡小體和DNA“梯狀”條帶明顯增加，從而證實了凋亡在調(diào)節(jié)女性月經(jīng)周期中確實起作用，并且周期性凋亡主要發(fā)生于功能層。
已有文獻報道[10]，正常子宮內(nèi)膜細胞在增生早期至分泌中期都表達Bcl-2基因產(chǎn)物，而在分泌晚期Bcl-2的表達消失；相應地，在增生期時Bcl-2蛋白在基底層占優(yōu)勢，并漸漸擴展到功能層的頂端，而分泌后期消失。Tabibzadeh等的報道支持了這一點，并進一步證明，在整個月經(jīng)周期中正常子宮內(nèi)膜連續(xù)表達Fas抗原和TNF受體。Liu等[1]用RT-PCR法亦檢測出子宮內(nèi)膜基細胞中，有p53、Bax、Fas基因的表達，而且，最近亦有文獻報道，caspase-1與子宮內(nèi)膜細胞凋亡有關(guān)。結(jié)合子宮內(nèi)膜月經(jīng)周期中E和P的周期性變化，即在分泌后期E和P迅速降低，推測子宮內(nèi)膜功能層細胞與GCs類似，在E和P啟動下調(diào)控各種凋亡相關(guān)基因的表達，使子宮內(nèi)膜呈周期性變化。三、子宮內(nèi)膜異位癥和細胞凋亡的關(guān)系
正常情況下，子宮內(nèi)膜組織僅限制于子宮內(nèi)膜，若其植入機體其它部位并生長，即稱為子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis’ET）。它是一種婦科常見病，發(fā)病率占育齡婦女的10%~15%。目前多用逆行月經(jīng)、淋巴擴散、化生及胎性剩余等概念來解釋ET的發(fā)生機制，并且ET的發(fā)生與免疫系統(tǒng)異常有關(guān)，異位組織可抵抗單核細胞和巨噬細胞介導的細胞毒性。盡管這可部分解釋為什么異位組織可長期在異位部位生長，但關(guān)于異位組織的異常存活是否與調(diào)亡抑制有關(guān)，直到最近才有報道。Gebel等[11’12]用ELISA法檢測了16例ET患者和10例對照者正常位和異位子宮內(nèi)膜組織自發(fā)凋亡率。結(jié)果正常者子宮內(nèi)膜組織自發(fā)凋亡率為1.43±0.11（吸光率），而ET患者的正常位和異位子宮內(nèi)膜組織的自發(fā)凋亡率分別為0.63±0.1和0.26±0.06，自發(fā)凋亡率明顯降低，且這種降低與月經(jīng)周期無關(guān)，并隨著ET嚴重程度增加而進一步降低。提示ET患者子宮內(nèi)膜組織對凋亡的抵抗性可能是ET發(fā)生的原因之一。
最近，Watanabe等[11]報道，ET患者的正常位和異位子宮內(nèi)膜組織皆能表達Fas和Bcl-2。Sbracia等[13]的進一步研究表明，ET患者的正常位子宮內(nèi)膜在增生期Bcl-2蛋白陽性率高，而Fas抗原降低；到黃體期后，Bcl-2陽性率降低，而Fas陽性率增加。但在異位子宮內(nèi)膜組織僅Bcl-2陽性，而Fas抗原陰性。這進一步證實了異位子宮內(nèi)膜組織凋亡敏感性降低。然而，Tao等[10]卻報道，ET患者的正常位和異位子宮內(nèi)膜組織皆比正常者的子宮內(nèi)膜組織表達更高的Bas、Bak及Bcl-Xlong，而僅在腺上皮和少許基細胞表達Bcl-2。Bax、Bak及Bcl-Xlong皆可促進細胞凋亡。這種不一致的結(jié)果是否說明ET患者的組織有不同的凋亡方式，尚無定論。ET患者子宮內(nèi)膜組織自發(fā)凋亡的降低是否由于這些組織的細胞不能表達與啟動凋亡有關(guān)的表面受體，或者凋亡信號不能正確傳導，這還需進一步研究。
ET患者可致不孕已眾所周知。子宮內(nèi)膜異位組織最常見于卵巢，嚴重者可出現(xiàn)巧克力囊腫，并引起盆腔器官的廣泛粘連。研究表明[14，15]，ET患者卵巢泡的壁GCs和卵丘細胞的凋亡小體發(fā)生率皆比正常者明顯升高，且隨ET嚴重程度增加而增加，有巧克力囊腫者比無巧克力囊腫者的GCs的凋亡小體發(fā)生率高。而且，在體外受精（IVF）中的ET患者的卵母細胞俘獲數(shù)及成熟卵母細胞數(shù)皆降低。用ET患者的卵進行體外受精-胚移植（IVF-ET），胚胎的植入率降低，其妊娠率也相應降低。這可能與ET患者的卵母細胞質(zhì)量降低有關(guān)。卵丘細胞凋亡率的增高，可影響卵母細胞的正常發(fā)育；而壁GCs和卵丘細胞凋亡的增加皆可致卵泡閉鎖，導致成熟卵母細胞數(shù)降低。兩者皆可導致ET患者生育力的降低。
四、體外受精-胚胎移植中的細胞凋亡
IVF-ET已被廣泛用于治療不明原因性不孕、輸卵管性不孕、男性因素的不育以及ET患者的不孕。Nakahara等[6，7]在患者基礎(chǔ)上和個別卵泡基礎(chǔ)上都證實，在IVF-ET中，非妊娠者所用的卵泡的壁GCs的凋亡小體發(fā)生率明顯高于妊娠患者，提示卵泡壁GCs中凋亡小體的發(fā)生率可被作為IVF-ET成功的指標。但他們的研究同時證實，妊娠者與非妊娠者相比，前者的卵母細胞俘獲數(shù)、成熟卵母細胞數(shù)及子宮內(nèi)膜厚度均比后者高，而且Fujino等[16]對鼠的研究顯示，年齡對卵母細胞數(shù)量亦有深刻影響。提示，單純以GCs的凋亡率來預示IVF-ET的結(jié)果是不充分的，它可能只是影響IVF-ET成功的一個因素。
最近，Moreira等[17]又在單個卵巢基礎(chǔ)上研究了卵巢壁GCs凋亡率與卵巢生殖力之間的關(guān)系。研究顯示，盡管右側(cè)卵巢俘獲卵母細胞數(shù)稍高于左側(cè)卵巢，但兩側(cè)卵巢的壁GCs凋亡率并沒有明顯不同。他們又根據(jù)左右兩側(cè)卵巢俘獲卵母細胞總數(shù)將患者分為兩組進行比較，結(jié)果俘獲卵母細胞總數(shù)在8個以上者比小于7個的患者有顯著低的GCs凋亡率。此結(jié)果進一步提示，在IVF-ET中，單個卵泡的質(zhì)量低下，引起了患者總體生殖力的降低。
在IVF-ET中，�？梢姷揭恍┡咛ブ杏兴槠�，或有些胚胎停止發(fā)育，它們可能與凋亡有關(guān)。Stachecki等[19]的研究證實了這一點，他們認為胚胎的停滯發(fā)育和胚胎中有碎片與胚胎的凋亡有關(guān)，正常發(fā)育的胚胎凋亡小體發(fā)生率極低。Brener等[18]進一步證實，Bax和Bcl-2mRNA皆存在于2細胞至致密桑椹胚的所有植入前胚中，且Bax/Bcl-2的比率可預示胚胎的存活力。Liu等[1]用RT-PCR法亦證實退化胚胎中表達Bax和Fax基因產(chǎn)物，從而證實胚胎發(fā)育的好壞確定與細胞凋亡有關(guān)。在Liu等的研究中還觀察到一有趣現(xiàn)象，卵母細胞不表達Bax、p53及Bcl-2等基因產(chǎn)物，而受精后的胚胎卻表達，提示受精可能啟動了人胚胎凋亡相關(guān)基因的表達，但這種現(xiàn)象及其引起的原因還值得進一步探討。
結(jié) 論
隨著細胞凋亡研究的深入，女性生殖活動中細胞凋亡的研究也已取得很大進展。卵巢GCs的凋亡不僅受到p53、Bax、Fas、WT-1、Bcl-2等凋亡相關(guān)基因的調(diào)控，而且受到IGF、IGFBP、激活素，IFNγ等體液因子的調(diào)控，且它們的調(diào)控皆受促性腺激素的影響，提示卵巢GCs的凋亡主要受體液因素的調(diào)節(jié)。GCs凋亡細胞內(nèi)機制可能與caspases途徑及酰基鞘氨醇途徑有關(guān)。不同GCs亞群以及卵泡發(fā)育的不同時期GCs對凋亡的敏感性亦不同。子宮內(nèi)膜細胞亦發(fā)生凋亡，主要見于功能層，其凋亡可能受E和P的調(diào)節(jié)。GCs及子宮內(nèi)膜細胞凋亡的研究，主要為臨床服務，凋亡不僅與ET的發(fā)生有關(guān)，而且與女性不孕有關(guān)。目前，除了應對GCs和子宮內(nèi)膜細胞凋亡的確切機制進一步探討外，還應著重利用凋亡的有關(guān)機制來解決臨床上相關(guān)問題，如：能否通過抑制妊娠早期成熟黃體的凋亡，來治療習慣性流產(chǎn)；能否通過促進異位子宮內(nèi)膜組織凋亡來治療ET；能否在IVF-ET中胚生存的介質(zhì)中加入凋亡抑制劑以提高胚存活力和質(zhì)量；以及能否通過抑制卵泡細胞凋亡來減緩卵泡的排空，從而推遲月經(jīng)，延緩衰老等等�？傊�，女性生殖活動中細胞凋亡的研究還有待進一步深入。
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