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情志病證動物實驗技術(shù)研究論文
在日常學(xué)習(xí)和工作中，許多人都寫過論文吧，論文是進行各個學(xué)術(shù)領(lǐng)域研究和描述學(xué)術(shù)研究成果的一種說理文章。還是對論文一籌莫展嗎？以下是小編幫大家整理的情志病證動物實驗技術(shù)研究論文，希望對大家有所幫助。
摘要：
隨著人們生活節(jié)奏不斷加快，不良情志刺激日益威脅人們健康，情志病證的研究已逐漸成為熱點。在情志病證的研究中，動物實驗開展較多，實驗技術(shù)則至關(guān)重要�，F(xiàn)就情志病證動物實驗相關(guān)技術(shù)作一淺析，以期對現(xiàn)代情志病證的研究有所裨益。
關(guān)鍵詞：
情志病證，實驗技術(shù)，動物實驗
引言：
情志病證[1]是以情志刺激為主要病因或誘因而發(fā)生的疾病，發(fā)病后有明顯的情志癥狀的病癥，也包括由臟腑功能失調(diào)引起的表現(xiàn)出異常情志反應(yīng)的疾病。隨著現(xiàn)代社會的不斷發(fā)展，情志病癥越來越引起人們重視。動物實驗是研究疾病發(fā)生機制和評價藥物效應(yīng)的有力工具，而動物實驗所用到的實驗技術(shù)則成為科研中必要且重要的關(guān)鍵所在。筆者通過檢索國內(nèi)外文獻，結(jié)合前期工作經(jīng)驗，并不斷摸索改進，形成了較為成熟的情志病證動物實驗技術(shù)�，F(xiàn)就幾種較為常用的情志病證動物實驗技術(shù)進行梳理，以期對現(xiàn)代情志病證動物實驗的開展提供技術(shù)支持。
需特別指出的是，所有實驗動物均為大鼠，所有實驗步驟均遵守國際關(guān)于實驗動物的倫理道德標(biāo)準(zhǔn)要求[2]。
1、取材
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為“腦”屬于神經(jīng)系統(tǒng)，腦功能紊亂外在反應(yīng)為情緒異常，并隨之導(dǎo)致植物神經(jīng)功能系統(tǒng)異常。情緒與大腦的學(xué)習(xí)和記憶、語言和思維等活動均屬于腦的高級整合功能，故情志病證動物實驗研究的原材料則主要為腦組織和血，故取材技術(shù)主要為取全腦、取腦區(qū)和取血技術(shù)。
1.1取全腦
該項技術(shù)的成熟是在國內(nèi)外[3，4]研究的基礎(chǔ)上結(jié)合筆者所在團隊的不斷改進，探索出適于情志病證的取材技術(shù)。
(1)麻醉:2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射，(2)固定:仰臥位，(3)心臟灌流:剪開腹腔、橫膈膜，弧形向上剪開胸腔，充分暴露心臟。將灌流針頭尖端磨平[5]，從左心尖向大鼠右上45°進針至主動脈根部，用動脈夾固定針頭防止灌注針?biāo)擅摚S即剪開右心耳，注射器抽取生理鹽水經(jīng)灌注針快速灌流至全身，直至右心耳流出澄清液體，約200mL。改為灌注4%多聚甲醛，先快后慢[6]，可見尾巴翹起和四肢顫動等末梢神經(jīng)刺激反應(yīng)，直至全身僵直，約200mL，(4)取全腦灌流結(jié)束后，迅速斷頭剝腦殼，小心取出全腦，(5)存放放在預(yù)先存有4%多聚甲醛的離心管中，于4℃冰箱進行后固定2~4h。隨后依次移入10%、20%、30%蔗糖溶液中行梯度脫水，蔗糖溶液的體積約為腦組織的5倍[4];更換標(biāo)準(zhǔn):腦組織完全沉降到管底;30%蔗糖溶液4℃可保存腦組織約3~6個月。
1.2取腦區(qū)
(1)麻醉、斷頭:2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)[7]腹腔注射，快速斷頭，(2)剝腦殼:在冰上快速、精準(zhǔn)的進行，沿矢狀線剪開，暴露顱骨，在兩眼連線與矢狀線的交點處用小剪刀插入顱骨，撬開腦殼，迅速剝離硬腦膜，取出全腦，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗多余的血液，(3)取腦區(qū)根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》用小彎鑷在冰上快速分離出所需腦區(qū)[8，9]，放入預(yù)冷的EP管中，液氮速凍，-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>
1.3取血
取血技術(shù)主要有斷頭取血和腹腔取血二種方法。研究[10]表明不同的取血方法對大鼠的生化指標(biāo)會產(chǎn)生明顯的影響。斷頭取血多為動/靜脈混合血，亦可混入組織液、動物毛發(fā)等，易發(fā)生溶血致檢測值升高[11];且斷頭取血可引起應(yīng)激反應(yīng)，過強的應(yīng)激反應(yīng)會引起機體一系列指標(biāo)的變化，甚至可能會對研究結(jié)果產(chǎn)生背景性干擾[12，13];此外，應(yīng)激還會引起神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂。而情志病證的研究與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)息息相關(guān)，故應(yīng)采用腹腔取血技術(shù)。
(1)麻醉:2%戊巴比妥鈉(50mg/kg體質(zhì)量)腹腔注射，(2)暴露腹主動脈:剪開腹腔，充分暴露腹主動脈，(3)取血:在腹主動脈的分叉處，將注射器針頭的楔面朝向下插入腹主動脈，可看到血液自動流入注射器內(nèi)，之后抽取適量的血液，(4)離心:移入一次性試管中，靜置30min，3500r/min離心15min，取上清于EP管中，-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>
2、組織形態(tài)學(xué)技術(shù)
對情志病證動物實驗研究過程中所獲得的全腦組織材料進行組織切片并染色從而在顯微鏡下進行形態(tài)學(xué)觀察。
2.1組織切片
組織切片是指利用切片機將動、植物組織器官切成薄片并加以染色在顯微鏡下進行觀察的技術(shù)。用以研究器官組織、細胞的微細結(jié)構(gòu)，并可長期保存。在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、組織胚胎學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。因支持劑不同可分為石蠟切片、冰凍切片等。腦組織本身比較柔軟、含水量大;冰凍切片能較完好地保存細胞在固定狀態(tài)的酶和抗原活性。故其[14]在情志病證研究中最為常用，特在此具體介紹。
(1)預(yù)處理:將腦組織從蔗糖溶液中取出，用PBS沖洗后吸水紙拭干[15]，放入冰凍切片機中冰凍5min，(2)包埋:以O(shè)CT或辦公用膠水[16]打底，腦組織固定于切片機探頭上，行半包埋處理，(3)切片:于-20℃[17]環(huán)境下作連續(xù)冠狀冰凍切片，每隔3張取1張切片組成1套，每套切片約5張，每片厚26μm，采用冰凍保存液收片保存于-20℃。
2.2組織切片染色
2.2.1HE染色:
在組織形態(tài)學(xué)方面，HE染色是一項基本技術(shù)，觀察直觀、操作簡便易于掌握、可重復(fù)性高且經(jīng)濟省時[18]。采用冰凍切片法[19，20]制備切片，貼于多聚賴氨酸包被過的載玻片上，晾干備用。
冰凍切片HE染色[21，22]:蘇木素5min→自來水30s→1%鹽酸乙醇10s→自來水5min→伊紅5s→自來水5s→80%乙醇5s→95%乙醇5s→無水乙醇Ⅰ5s→二甲苯Ⅰ5min→二甲苯Ⅱ5min→中性樹膠封片
2.2.2免疫熒光雙標(biāo)技術(shù):
冰凍切片免疫熒光染色具有操作快、步驟簡單、組織抗原保存良好、特異性強、敏感度高等特點[23]，故多選用冰凍切片。免疫熒光技術(shù)有貼片法[24]和漂片法[25]，動物實驗所需腦片量大，時間有限，故選擇冰凍切片漂片法行免疫熒光術(shù)。
首先需確定進行雙標(biāo)的2個一抗的種屬來源。若來源不同，雙標(biāo)可同時進行;若來源相同，則必須分別標(biāo)記�，F(xiàn)具體介紹同時進行免疫的方法[26]。
(1)漂洗:從冰凍保存液中取出腦片，放入6孔板中用1×PBS洗5min×6，(2)封閉:用5%BSA室溫封閉切片1h，(3)一抗混合液孵育:加入一標(biāo)、二標(biāo)一抗混合液37℃孵育1h后，4℃孵育過夜，(4)漂洗:腦片經(jīng)1×PBS漂洗5min×3。加入一標(biāo)二抗37℃孵育2h，注意避光，(5)二抗混合液孵育:加入一標(biāo)二抗、二標(biāo)二抗混合液37℃孵育2h，注意避光，(6)貼片與封片:1×PBS漂洗5min×3后腦片轉(zhuǎn)移至載玻片上，避光自然晾干;滴加適量的防淬滅劑后，蓋上蓋玻片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。
3、其他
3.1腦立體定位顯微注射
情志病證研究與腦密切相關(guān)，而腦立體定位顯微注射則是一項必要且重要的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于各種與腦相關(guān)的研究中。其具體操作流程[27]如下:
(1)麻醉:3%戊巴比妥鈉(80mg/kg體質(zhì)量)[7]腹腔注射行深度麻醉，(2)固定:按照GeorgePaxinos和CharlesWatson(第六版)[28]的大鼠腦立體定位圖譜的規(guī)定，采取平顱頭位固定法，利用動物雙側(cè)內(nèi)耳孔與門齒三點進行固定，調(diào)整定位儀牙托位置，使其垂直位置在兩耳桿連線水平面以下(3.3±0.4)mm，前囟和后囟在同一水平高度，(3)手術(shù):大鼠頭部剃毛消毒，沿矢狀線作一正中切口，剝離筋膜，暴露顱骨，使顱骨骨縫清晰暴露，找到前、后囟點，(4)定位、注射:腦立體定位儀連接微量注射針，將前囟點三維坐標(biāo)歸零作為零點。參照《大鼠腦立體定位圖譜》定位注射部位的坐標(biāo)，顱骨鉆對定位坐標(biāo)點進行鉆孔，剝離硬腦膜，將微量注射針?biāo)腿胱⑸洳课�，微量注射泵定時定量連續(xù)注入所需物質(zhì)。注射結(jié)束后靜置10min，(5)恢復(fù):牙科水泥固定鉆孔，縫合傷口，手術(shù)區(qū)域注射青霉素預(yù)防感染。術(shù)后腹腔注射青霉素連續(xù)3d;每天監(jiān)視切口是否有任何分泌物、紅腫或開裂現(xiàn)象。
3.2微電極技術(shù)
微電極技術(shù)的誕生把人們對神經(jīng)電的認識帶入了新的時代，神經(jīng)電生理記錄技術(shù)已經(jīng)成為研究神經(jīng)功能的重要手段。其步驟[29]:(1)腦立體定位:方法同3.1，(2)電信號采集系統(tǒng)的連接:將含2%滂胺天藍的6.8%醋酸鈉溶液注入到拉制好的玻璃微電極(阻抗為10~20MΩ)內(nèi)，靜止數(shù)秒后充滿尖端，將直徑0.6mm的銀絲插入到電極內(nèi)，另一端連接到放大器信號采集電極，依次連接生物機能實驗系統(tǒng)。參數(shù)設(shè)置:增益:1mV，時間常數(shù):0.001，高頻率波:1KHz，采樣率:10KHz，掃描速度:1.25s/div。并將放大器參考電極放在大鼠耳上。同時音箱連結(jié)實時監(jiān)控，(3)插入電極記錄電活動:將電極固定到立體定位儀上，按照3.1的方法定位鉆孔，然后旋轉(zhuǎn)下針，當(dāng)接觸腦表面時要密切注視電極尖端，確保順利插入腦組織。定位坐標(biāo)接近特定腦區(qū)時，緩慢下針，注意監(jiān)聽的器聲音變化，當(dāng)出現(xiàn)類似于外界干擾的劇烈電位變化，或者是微弱的“劈劈啪啪”的聲音(清脆而節(jié)奏鮮明)，即為記錄到的神經(jīng)元放電活動。
3.3光遺傳學(xué)技術(shù)
光遺傳學(xué)技術(shù)是光學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合后產(chǎn)生的一門新技術(shù)。這項技術(shù)主要是將光敏感蛋白表達在特定神經(jīng)元中，通過不同波長和頻率的光刺激改變蛋白功能，進而達到調(diào)控清醒動物腦內(nèi)靶神經(jīng)元功能的目的。其步驟是:(1)植入光電極[30]，(2)光刺激和記錄:植入光電極后數(shù)天，待動物完全清醒后，在進行光刺激的同時實時記錄神經(jīng)元的放電情況，記錄腦電圖和進行機能性磁共振成像[31]。此外，在體外，在光刺激的同時，用腦片電生理的方法記錄神經(jīng)元放電信號。
4、小結(jié)
近年來情志與疾病和健康的關(guān)系已成為中西醫(yī)學(xué)共同關(guān)注的熱點，對情志病證的相關(guān)探索已成為當(dāng)前國內(nèi)醫(yī)學(xué)、心理學(xué)界最為活躍的領(lǐng)域之一。而動物實驗是生命科學(xué)研究中的重要組成部分，已成為科學(xué)研究中的一個標(biāo)桿[32]。適宜的實驗技術(shù)在動物實驗開展過程中則是至關(guān)重要的保障。
目前，隨著現(xiàn)代科技的飛速發(fā)展，醫(yī)學(xué)實驗技術(shù)也不斷發(fā)展、創(chuàng)新，同時為科研提供了很大的幫助。然而，卻帶來了很大的弊端(信息泛濫、有用信息少之又少)。在信息泛濫的今天，對情志病證動物實驗技術(shù)的闡述更是無系統(tǒng)、無標(biāo)準(zhǔn)。因此在情志病證動物實驗開展的過程中，困難重重(耗時、耗力、耗財、結(jié)果不理想)。本文在通過檢索國內(nèi)外文獻，并不斷開展情志病證動物實驗，摸索并熟練掌握了情志病證相關(guān)的實驗技術(shù)，在此進行詳細闡述，以期為情志病證動物實驗的開展提供技術(shù)支持，從而為科研工作提供一定程度的便利。
參考文獻
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