情志病證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究論文
在日常學(xué)習(xí)和工作中，許多人都寫(xiě)過(guò)論文吧，論文是進(jìn)行各個(gè)學(xué)術(shù)領(lǐng)域研究和描述學(xué)術(shù)研究成果的一種說(shuō)理文章。還是對(duì)論文一籌莫展嗎？以下是小編幫大家整理的情志病證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究論文，希望對(duì)大家有所幫助。
摘要：
隨著人們生活節(jié)奏不斷加快，不良情志刺激日益威脅人們健康，情志病證的研究已逐漸成為熱點(diǎn)。在情志病證的研究中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開(kāi)展較多，實(shí)驗(yàn)技術(shù)則至關(guān)重要�，F(xiàn)就情志病證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)技術(shù)作一淺析，以期對(duì)現(xiàn)代情志病證的研究有所裨益。
關(guān)鍵詞：
情志病證，實(shí)驗(yàn)技術(shù)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
引言：
情志病證[1]是以情志刺激為主要病因或誘因而發(fā)生的疾病，發(fā)病后有明顯的情志癥狀的病癥，也包括由臟腑功能失調(diào)引起的表現(xiàn)出異常情志反應(yīng)的疾病。隨著現(xiàn)代社會(huì)的不斷發(fā)展，情志病癥越來(lái)越引起人們重視。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是研究疾病發(fā)生機(jī)制和評(píng)價(jià)藥物效應(yīng)的有力工具，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所用到的實(shí)驗(yàn)技術(shù)則成為科研中必要且重要的關(guān)鍵所在。筆者通過(guò)檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，結(jié)合前期工作經(jīng)驗(yàn)，并不斷摸索改進(jìn)，形成了較為成熟的情志病證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)�，F(xiàn)就幾種較為常用的情志病證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行梳理，以期對(duì)現(xiàn)代情志病證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展提供技術(shù)支持。
需特別指出的是，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為大鼠，所有實(shí)驗(yàn)步驟均遵守國(guó)際關(guān)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的倫理道德標(biāo)準(zhǔn)要求[2]。
1、取材
現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腦”屬于神經(jīng)系統(tǒng)，腦功能紊亂外在反應(yīng)為情緒異常，并隨之導(dǎo)致植物神經(jīng)功能系統(tǒng)異常。情緒與大腦的學(xué)習(xí)和記憶、語(yǔ)言和思維等活動(dòng)均屬于腦的高級(jí)整合功能，故情志病證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的原材料則主要為腦組織和血，故取材技術(shù)主要為取全腦、取腦區(qū)和取血技術(shù)。
1.1取全腦
該項(xiàng)技術(shù)的成熟是在國(guó)內(nèi)外[3，4]研究的基礎(chǔ)上結(jié)合筆者所在團(tuán)隊(duì)的不斷改進(jìn)，探索出適于情志病證的取材技術(shù)。
(1)麻醉:2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射，(2)固定:仰臥位，(3)心臟灌流:剪開(kāi)腹腔、橫膈膜，弧形向上剪開(kāi)胸腔，充分暴露心臟。將灌流針頭尖端磨平[5]，從左心尖向大鼠右上45°進(jìn)針至主動(dòng)脈根部，用動(dòng)脈夾固定針頭防止灌注針?biāo)擅摚S即剪開(kāi)右心耳，注射器抽取生理鹽水經(jīng)灌注針快速灌流至全身，直至右心耳流出澄清液體，約200mL。改為灌注4%多聚甲醛，先快后慢[6]，可見(jiàn)尾巴翹起和四肢顫動(dòng)等末梢神經(jīng)刺激反應(yīng)，直至全身僵直，約200mL，(4)取全腦灌流結(jié)束后，迅速斷頭剝腦殼，小心取出全腦，(5)存放放在預(yù)先存有4%多聚甲醛的離心管中，于4℃冰箱進(jìn)行后固定2~4h。隨后依次移入10%、20%、30%蔗糖溶液中行梯度脫水，蔗糖溶液的體積約為腦組織的5倍[4];更換標(biāo)準(zhǔn):腦組織完全沉降到管底;30%蔗糖溶液4℃可保存腦組織約3~6個(gè)月。
1.2取腦區(qū)
(1)麻醉、斷頭:2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)[7]腹腔注射，快速斷頭，(2)剝腦殼:在冰上快速、精準(zhǔn)的進(jìn)行，沿矢狀線(xiàn)剪開(kāi)，暴露顱骨，在兩眼連線(xiàn)與矢狀線(xiàn)的交點(diǎn)處用小剪刀插入顱骨，撬開(kāi)腦殼，迅速剝離硬腦膜，取出全腦，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗多余的血液，(3)取腦區(qū)根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》用小彎鑷在冰上快速分離出所需腦區(qū)[8，9]，放入預(yù)冷的EP管中，液氮速凍，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
1.3取血
取血技術(shù)主要有斷頭取血和腹腔取血二種方法。研究[10]表明不同的取血方法對(duì)大鼠的生化指標(biāo)會(huì)產(chǎn)生明顯的影響。斷頭取血多為動(dòng)/靜脈混合血，亦可混入組織液、動(dòng)物毛發(fā)等，易發(fā)生溶血致檢測(cè)值升高[11];且斷頭取血可引起應(yīng)激反應(yīng)，過(guò)強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)引起機(jī)體一系列指標(biāo)的變化，甚至可能會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生背景性干擾[12，13];此外，應(yīng)激還會(huì)引起神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂。而情志病證的研究與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)息息相關(guān)，故應(yīng)采用腹腔取血技術(shù)。
(1)麻醉:2%戊巴比妥鈉(50mg/kg體質(zhì)量)腹腔注射，(2)暴露腹主動(dòng)脈:剪開(kāi)腹腔，充分暴露腹主動(dòng)脈，(3)取血:在腹主動(dòng)脈的分叉處，將注射器針頭的楔面朝向下插入腹主動(dòng)脈，可看到血液自動(dòng)流入注射器內(nèi)，之后抽取適量的血液，(4)離心:移入一次性試管中，靜置30min，3500r/min離心15min，取上清于EP管中，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
2、組織形態(tài)學(xué)技術(shù)
對(duì)情志病證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中所獲得的全腦組織材料進(jìn)行組織切片并染色從而在顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察。
2.1組織切片
組織切片是指利用切片機(jī)將動(dòng)、植物組織器官切成薄片并加以染色在顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察的技術(shù)。用以研究器官組織、細(xì)胞的微細(xì)結(jié)構(gòu)，并可長(zhǎng)期保存。在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、組織胚胎學(xué)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。因支持劑不同可分為石蠟切片、冰凍切片等。腦組織本身比較柔軟、含水量大;冰凍切片能較完好地保存細(xì)胞在固定狀態(tài)的酶和抗原活性。故其[14]在情志病證研究中最為常用，特在此具體介紹。
(1)預(yù)處理:將腦組織從蔗糖溶液中取出，用PBS沖洗后吸水紙拭干[15]，放入冰凍切片機(jī)中冰凍5min，(2)包埋:以O(shè)CT或辦公用膠水[16]打底，腦組織固定于切片機(jī)探頭上，行半包埋處理，(3)切片:于-20℃[17]環(huán)境下作連續(xù)冠狀冰凍切片，每隔3張取1張切片組成1套，每套切片約5張，每片厚26μm，采用冰凍保存液收片保存于-20℃。
2.2組織切片染色
2.2.1HE染色:
在組織形態(tài)學(xué)方面，HE染色是一項(xiàng)基本技術(shù)，觀(guān)察直觀(guān)、操作簡(jiǎn)便易于掌握、可重復(fù)性高且經(jīng)濟(jì)省時(shí)[18]。采用冰凍切片法[19，20]制備切片，貼于多聚賴(lài)氨酸包被過(guò)的載玻片上，晾干備用。
冰凍切片HE染色[21，22]:蘇木素5min→自來(lái)水30s→1%鹽酸乙醇10s→自來(lái)水5min→伊紅5s→自來(lái)水5s→80%乙醇5s→95%乙醇5s→無(wú)水乙醇Ⅰ5s→二甲苯Ⅰ5min→二甲苯Ⅱ5min→中性樹(shù)膠封片
2.2.2免疫熒光雙標(biāo)技術(shù):
冰凍切片免疫熒光染色具有操作快、步驟簡(jiǎn)單、組織抗原保存良好、特異性強(qiáng)、敏感度高等特點(diǎn)[23]，故多選用冰凍切片。免疫熒光技術(shù)有貼片法[24]和漂片法[25]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需腦片量大，時(shí)間有限，故選擇冰凍切片漂片法行免疫熒光術(shù)。
首先需確定進(jìn)行雙標(biāo)的2個(gè)一抗的種屬來(lái)源。若來(lái)源不同，雙標(biāo)可同時(shí)進(jìn)行;若來(lái)源相同，則必須分別標(biāo)記�，F(xiàn)具體介紹同時(shí)進(jìn)行免疫的方法[26]。
(1)漂洗:從冰凍保存液中取出腦片，放入6孔板中用1×PBS洗5min×6，(2)封閉:用5%BSA室溫封閉切片1h，(3)一抗混合液孵育:加入一標(biāo)、二標(biāo)一抗混合液37℃孵育1h后，4℃孵育過(guò)夜，(4)漂洗:腦片經(jīng)1×PBS漂洗5min×3。加入一標(biāo)二抗37℃孵育2h，注意避光，(5)二抗混合液孵育:加入一標(biāo)二抗、二標(biāo)二抗混合液37℃孵育2h，注意避光，(6)貼片與封片:1×PBS漂洗5min×3后腦片轉(zhuǎn)移至載玻片上，避光自然晾干;滴加適量的防淬滅劑后，蓋上蓋玻片，激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察。
3、其他
3.1腦立體定位顯微注射
情志病證研究與腦密切相關(guān)，而腦立體定位顯微注射則是一項(xiàng)必要且重要的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于各種與腦相關(guān)的研究中。其具體操作流程[27]如下:
(1)麻醉:3%戊巴比妥鈉(80mg/kg體質(zhì)量)[7]腹腔注射行深度麻醉，(2)固定:按照GeorgePaxinos和CharlesWatson(第六版)[28]的大鼠腦立體定位圖譜的規(guī)定，采取平顱頭位固定法，利用動(dòng)物雙側(cè)內(nèi)耳孔與門(mén)齒三點(diǎn)進(jìn)行固定，調(diào)整定位儀牙托位置，使其垂直位置在兩耳桿連線(xiàn)水平面以下(3.3±0.4)mm，前囟和后囟在同一水平高度，(3)手術(shù):大鼠頭部剃毛消毒，沿矢狀線(xiàn)作一正中切口，剝離筋膜，暴露顱骨，使顱骨骨縫清晰暴露，找到前、后囟點(diǎn)，(4)定位、注射:腦立體定位儀連接微量注射針，將前囟點(diǎn)三維坐標(biāo)歸零作為零點(diǎn)。參照《大鼠腦立體定位圖譜》定位注射部位的坐標(biāo)，顱骨鉆對(duì)定位坐標(biāo)點(diǎn)進(jìn)行鉆孔，剝離硬腦膜，將微量注射針?biāo)腿胱⑸洳课�，微量注射泵定時(shí)定量連續(xù)注入所需物質(zhì)。注射結(jié)束后靜置10min，(5)恢復(fù):牙科水泥固定鉆孔，縫合傷口，手術(shù)區(qū)域注射青霉素預(yù)防感染。術(shù)后腹腔注射青霉素連續(xù)3d;每天監(jiān)視切口是否有任何分泌物、紅腫或開(kāi)裂現(xiàn)象。
3.2微電極技術(shù)
微電極技術(shù)的誕生把人們對(duì)神經(jīng)電的認(rèn)識(shí)帶入了新的時(shí)代，神經(jīng)電生理記錄技術(shù)已經(jīng)成為研究神經(jīng)功能的重要手段。其步驟[29]:(1)腦立體定位:方法同3.1，(2)電信號(hào)采集系統(tǒng)的連接:將含2%滂胺天藍(lán)的6.8%醋酸鈉溶液注入到拉制好的玻璃微電極(阻抗為10~20MΩ)內(nèi)，靜止數(shù)秒后充滿(mǎn)尖端，將直徑0.6mm的銀絲插入到電極內(nèi)，另一端連接到放大器信號(hào)采集電極，依次連接生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。參數(shù)設(shè)置:增益:1mV，時(shí)間常數(shù):0.001，高頻率波:1KHz，采樣率:10KHz，掃描速度:1.25s/div。并將放大器參考電極放在大鼠耳上。同時(shí)音箱連結(jié)實(shí)時(shí)監(jiān)控，(3)插入電極記錄電活動(dòng):將電極固定到立體定位儀上，按照3.1的方法定位鉆孔，然后旋轉(zhuǎn)下針，當(dāng)接觸腦表面時(shí)要密切注視電極尖端，確保順利插入腦組織。定位坐標(biāo)接近特定腦區(qū)時(shí)，緩慢下針，注意監(jiān)聽(tīng)的器聲音變化，當(dāng)出現(xiàn)類(lèi)似于外界干擾的劇烈電位變化，或者是微弱的“劈劈啪啪”的聲音(清脆而節(jié)奏鮮明)，即為記錄到的神經(jīng)元放電活動(dòng)。
3.3光遺傳學(xué)技術(shù)
光遺傳學(xué)技術(shù)是光學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合后產(chǎn)生的一門(mén)新技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)主要是將光敏感蛋白表達(dá)在特定神經(jīng)元中，通過(guò)不同波長(zhǎng)和頻率的光刺激改變蛋白功能，進(jìn)而達(dá)到調(diào)控清醒動(dòng)物腦內(nèi)靶神經(jīng)元功能的目的。其步驟是:(1)植入光電極[30]，(2)光刺激和記錄:植入光電極后數(shù)天，待動(dòng)物完全清醒后，在進(jìn)行光刺激的同時(shí)實(shí)時(shí)記錄神經(jīng)元的放電情況，記錄腦電圖和進(jìn)行機(jī)能性磁共振成像[31]。此外，在體外，在光刺激的同時(shí)，用腦片電生理的方法記錄神經(jīng)元放電信號(hào)。
4、小結(jié)
近年來(lái)情志與疾病和健康的關(guān)系已成為中西醫(yī)學(xué)共同關(guān)注的熱點(diǎn)，對(duì)情志病證的相關(guān)探索已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)醫(yī)學(xué)、心理學(xué)界最為活躍的領(lǐng)域之一。而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是生命科學(xué)研究中的重要組成部分，已成為科學(xué)研究中的一個(gè)標(biāo)桿[32]。適宜的實(shí)驗(yàn)技術(shù)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開(kāi)展過(guò)程中則是至關(guān)重要的保障。
目前，隨著現(xiàn)代科技的飛速發(fā)展，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)也不斷發(fā)展、創(chuàng)新，同時(shí)為科研提供了很大的幫助。然而，卻帶來(lái)了很大的弊端(信息泛濫、有用信息少之又少)。在信息泛濫的今天，對(duì)情志病證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)的闡述更是無(wú)系統(tǒng)、無(wú)標(biāo)準(zhǔn)。因此在情志病證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開(kāi)展的過(guò)程中，困難重重(耗時(shí)、耗力、耗財(cái)、結(jié)果不理想)。本文在通過(guò)檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，并不斷開(kāi)展情志病證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，摸索并熟練掌握了情志病證相關(guān)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在此進(jìn)行詳細(xì)闡述，以期為情志病證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的開(kāi)展提供技術(shù)支持，從而為科研工作提供一定程度的便利。
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