談黃芪和三七有效成分對(duì)腦缺血再灌注后細(xì)胞凋亡的影響論文
腦缺血再灌注損傷( Cerebral ischemia-reperfusioninjury，CIR) 是指缺血腦組織在恢復(fù)血液灌注后，腦組織損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象。腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的損傷形式可分為急性損傷和遲發(fā)性損傷，而細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致遲發(fā)性損傷的主要病理機(jī)制。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在相關(guān)基因的控制下進(jìn)行的自主的程序化的死亡過(guò)程。在凋亡過(guò)程中，半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶( cysteine aspartic acid specific protease，caspase) ，起到重要的調(diào)控作用。caspase-3 是caspase 家族中重要成員之一，是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末效應(yīng)部分，是細(xì)胞凋亡的必經(jīng)之路，故caspase-3 表達(dá)上調(diào)可作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。
依達(dá)拉奉是一種腦保護(hù)劑，其主要作用是清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，保護(hù)腦、血管內(nèi)皮和神經(jīng)細(xì)胞避免氧化損傷，臨床上主要用于治療腦梗死，具有確切的臨床療效。近年來(lái)有研究表明，依達(dá)拉奉可明顯減少急性腦缺血再灌注大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)，故選擇其作為本研究的陽(yáng)性對(duì)照藥。
中醫(yī)認(rèn)為氣虛血瘀是缺血性中風(fēng)的主要病理機(jī)制，故可用益氣活血法進(jìn)行治療。黃芪是常用的益氣藥，三七是常用的活血藥，二者配伍，符合益氣活血的治療原則。中藥藥化研究發(fā)現(xiàn)，黃芪中具有抗腦缺血作用的主要有效成分為黃芪甲苷( 以下簡(jiǎn)稱ASTⅣ) ; 三七中具有抗腦缺血作用的主要有效成分包括人參皂苷Rb1( 以下簡(jiǎn)稱Rb1) 、人參皂苷Rg1( 以下簡(jiǎn)稱Rg1) 和三七皂苷R1( 以下簡(jiǎn)稱R1)。本研究從腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡方面探討黃芪和三七有效成分配伍抗腦缺血的作用機(jī)制，探索黃芪和三七有效成分配伍的組方規(guī)律，尋找其抗腦缺血的有效配伍組合，為黃芪和三七的進(jìn)一步合理開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料與方法
1. 1 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑
三七皂苷R1 對(duì)照品( 批號(hào): 12051001，規(guī)格:20 mg /支) 、黃芪甲苷對(duì)照品( 批號(hào): 12061101，規(guī)格:20 mg /支) 、人參皂苷Rb1 對(duì)照品( 批號(hào): 12051001，規(guī)格: 20 mg /支) 、人參皂苷Rg1 對(duì)照品( 批號(hào):12052401，規(guī)格: 20 mg /支) ，以上藥品均由成都曼思特生物科技有限公司提供。依達(dá)拉奉( 批號(hào): 80-090711，規(guī)格: 10 mg /支) ，由南京先聲東元制藥有限公司提供，給藥時(shí)用0. 9%氯化鈉稀釋，配成0. 4 mg /mL 溶液。蛋白質(zhì)抽提試劑盒( 產(chǎn)品貨號(hào): KeyGEN，由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司提供) 、BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒( 產(chǎn)品貨號(hào): AR0146，由武漢博士德生物工程有限公司提供提供) 、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Ⅲ( FITC)( 產(chǎn)品貨號(hào): MK1023，由武漢博士德生物工程有限公司提供) 、磷酸酶抑制劑復(fù)合物Ⅲ ( 產(chǎn)品貨號(hào):C500019-0001，由上海生工生物工程股份有限公司提供) ; 兔抗小鼠Caspase-3 抗體( 批號(hào): SC7148，購(gòu)自Santa Gruz Biotechnology) ，兔抗小鼠β-actin 抗體( 批號(hào): sc-130656，購(gòu)自Santa Gruz Biotechnology) ，均4℃保存; HRP-Goat Anti-Rabbit Ig ( H + L ) ( 批號(hào):SA00001-2，購(gòu)自Proteintech Group) ，- 20 ℃保存。
1. 2 動(dòng)物、分組及給藥方法
88 只SPF 級(jí)C57BL /6 小鼠，雄性，體重20 ～25g。飼養(yǎng)于SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，相對(duì)濕度40% ～60%、溫度20 ～ 26 ℃。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[9]，隨機(jī)分為以下11 組: 1. 假手術(shù)組，2. 模型組，3. 黃芪甲苷組，4. Rg1 組，5. Rb1 組，6. R1 組，7. 四種有效成分配伍組，8. 黃芪甲苷+ Rg1 組，9. 黃芪甲苷+ Rb1 組，10.黃芪甲苷+ R1 組，11. 陽(yáng)性對(duì)照藥依達(dá)拉奉組。各組給藥劑量: 1、2 組0. 5%羧甲基纖維素鈉10 mL /kg; 3組AST Ⅳ40 mg /kg; 4 組Rg1 50 mg /kg; 5 組Rb1 40mg /kg; 6 組R1 10 mg /kg; 7 組AST Ⅳ和Rb1 各40mg /kg，Rg1 50 mg /kg，R1 10 mg /kg; 8 組AST 40 mg /kg，Rg1 50 mg /kg; 9 組AST Ⅳ和Rb1 各40 mg /kg; 10組AST 40 mg /kg，R1 10 mg /kg; 11 組依達(dá)拉奉4 mg /kg。第1 - 10 組均灌胃給藥，1次/d; 第11 組腹腔注射給藥，2次/d。連續(xù)給藥3 d，末次給藥1 h后進(jìn)行造模。
1. 3 腦缺血模型制作
乙醚麻醉小鼠，仰臥位固定，頸部手術(shù)，用動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈20 min，造成腦缺血。假手術(shù)組也進(jìn)行頸部手術(shù)，但不夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈。再灌注24 h 后，將小鼠迅速斷頭，取出腦組織做相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。
1. 4 神經(jīng)元凋亡檢測(cè)
取視交叉后腦組織，固定、脫水、石蠟包埋，作冠狀切片，厚度約為7 μm，TUNEL 法測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞凋亡，計(jì)算凋亡率( %) 。
1. 5 caspase-3 蛋白表達(dá)檢測(cè)
取視交叉前腦組織，裂解、離心。采用BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，并計(jì)算含110μg 蛋白的裂解液容積作為上樣量。western-blot 法檢測(cè)caspase-3 蛋白和內(nèi)參照蛋白β-actin 的表達(dá)。用Image-Pro Plus 6. 0 圖像分析軟件測(cè)定caspase-3 和內(nèi)參蛋白( β-actin) 的累積光密度值( IOD) ，并以兩者IOD 的比值作為caspase-3 的相對(duì)表達(dá)量。
1. 6 統(tǒng)計(jì)分析方法
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采運(yùn)用SPSS16. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組均數(shù)采用單因素方差分析，方差齊者用最小顯著性差異法檢驗(yàn)。P < 0. 05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2. 1 各組神經(jīng)元凋亡率
各組神經(jīng)元凋亡率的比較見(jiàn)圖1。與假手術(shù)組比較，模型組凋亡率顯著升高( P < 0. 01) 。與模型組比較，各給藥組凋亡率顯著降低( 均P < 0. 01) 。ASTⅣ + Rg1 組與AST Ⅳ + R1 組降低凋亡率的效應(yīng)分別大于各有效成分單用組( 均P < 0. 01) 。四種有效成分配伍組降低凋亡率的效應(yīng)大于四種有效成分單用組及AST Ⅳ + Rb1 組( 均P < 0. 01) ，與陽(yáng)性對(duì)照藥依達(dá)拉奉組、AST Ⅳ + R1 組、AST Ⅳ + Rg1 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 均P > 0. 05) 。2. 2 各組腦組織caspase-3 蛋白表達(dá)各組腦組織caspase-3 蛋白表達(dá)的比較見(jiàn)圖2。與假手術(shù)組比較: ◇P < 0. 05，◇◇ P < 0. 01; 與模型組比較:△P < 0. 05，△△P < 0. 01; 與AST Ⅳ組比較: * P < 0. 05，** P<0. 01; 與Rg1 組比較: □P < 0. 05，□□ P < 0. 01; 與Rb1 組比較: P < 0. 05，P < 0. 01; 與R1 組比較: ☆ P < 0. 05，☆☆ P <0. 01; 與四種有效成分配伍組比較:P < 0. 05，P < 0. 01a. caspase-3 蛋白表達(dá)的western-bloting 圖譜; b. caspase-3 蛋白表達(dá)的比較圖2 各組腦組織caspase-3 蛋白表達(dá)的比較( 珔x ± s，n = 8) 與假手術(shù)組比較，模型組caspase-3 表達(dá)顯著升高( P < 0. 01) 。與模型組比較，各給藥組caspase-3 表達(dá)顯著下降( 均P < 0. 01) 。AST Ⅳ + Rg1 組與ASTⅣ + R1 組降低caspase-3 表達(dá)的效應(yīng)分別大于各有效成分單用組( P < 0. 01 或P < 0. 05) 。四種有效成分配伍組降低caspase-3 表達(dá)的效應(yīng)大于各有效成分單用組、AST Ⅳ + R1 組及AST Ⅳ + Rb1 組( P < 0. 01或P < 0. 05) ，與陽(yáng)性對(duì)照藥依達(dá)拉奉組、AST Ⅳ +Rg1 組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( 均P >0. 05) 。
3 討論
本研究結(jié)果顯示，對(duì)小鼠進(jìn)行腦缺血再灌注處理后，其腦組織發(fā)生細(xì)胞凋亡，caspase-3 蛋白表達(dá)增加。黃芪與三七的各種有效成分單用及配伍均可減輕缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，降低凋亡率，減少caspase-3 蛋白的表達(dá)。AST Ⅳ + Rg1 與AST Ⅳ + R1降低凋亡率和減少caspase-3 蛋白表達(dá)的效應(yīng)分別大于各藥物單用，表明黃芪甲苷與人參皂苷Rg1 或三七皂苷R1 配伍對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用增強(qiáng)，可能具有協(xié)同增效作用。四種有效成分配伍降低凋亡率的效應(yīng)大于四種有效成分單用及AST Ⅳ + Rb1，減少caspase-3 蛋白表達(dá)的效應(yīng)大于四種有效成分單用及AST Ⅳ + Rb1 和AST Ⅳ + R1，表明四種有效成分配伍能增強(qiáng)抗細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。以上分析結(jié)果提示黃芪甲苷與三七的有效成分可以抑制腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，黃芪甲苷與人參皂苷Rg1配伍、黃芪甲苷與三七皂R1 配伍以及四種有效成分配伍對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用增強(qiáng)。
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