談慢性鋁暴露對大鼠海馬鈣離子穩(wěn)態(tài)及CaMKⅡ和CREB 活性的影響論文
鋁( Al) 是一種慢性神經(jīng)毒性物質(zhì)，隨著鋁的生物利用度增加，其與許多神經(jīng)變性疾病密切相關，包括阿爾茨海默病( AD) 、肌萎縮性側索硬化癥( ALS) 、帕金森癡呆和海灣戰(zhàn)爭綜合征。動物實驗證明，Al 鹽可引起許多動物腦內(nèi)形成神經(jīng)纖維纏結( NFT) 病理變化，如兔、貓、小鼠、大鼠和猴。最新的研究結果也證明，Al 暴露可導致腦內(nèi)產(chǎn)生AD 樣病理變化以及認知障礙，并且飲水中Al 含量與AD 患者死亡率呈正相關。慢性Al 暴露可以增強AD 患者腦內(nèi)NFT 和Aβ 的形成，從而增加淀粉樣斑塊的體積和數(shù)量。在神經(jīng)元中，鈣離子( Ca2 + ) 持續(xù)性升高可造成神經(jīng)毒性，與急慢性神經(jīng)退行性病變中的神經(jīng)損傷密切相關。神經(jīng)元內(nèi)的Al 可以影響靜息Ca2 + 水平，減慢Ca2 + 流出細胞質(zhì)。同時，Al 可以抑制調(diào)節(jié)Ca2 + 的相關蛋白表達。因此，了解鋁暴露對Ca2 + 穩(wěn)態(tài)的影響對于明確鋁神經(jīng)毒性的機制，具有十分重要的意義。Ca2 + /鈣調(diào)蛋白( CaM) 依賴的蛋白激酶Ⅱ( CaMKⅡ) 是神經(jīng)細胞興奮性轉錄耦聯(lián)的關鍵媒介，也是突觸可塑性改變的關鍵蛋白。此外， cAMP 反應元件結合蛋白( CREB) 是CaMKⅡ的下游分子之一，在突觸可塑性中具有重要作用，激活CREB 可促進多種與突觸可塑性相關的轉錄因子的轉錄，從而誘導產(chǎn)生一些與學習記憶十分相關的蛋白分子。研究表明，Al 在腦內(nèi)特定的敏感區(qū)域內(nèi)選擇性地沉積，如海馬區(qū)等。但是，慢性Al 暴露對大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元內(nèi)的Ca2 + 穩(wěn)態(tài)以及其下游CaMKⅡ、CREB 信號分子活性的影響尚未見報道。
1 材料與方法
1. 1 主要材料
選擇60 只斷乳后Wistar 大鼠( 體重約30 g) ，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。CREB 抗體、磷酸化( p) -CREB 抗體( Cell Signal 公司) ; CaMKⅡ抗體、p-CaMKⅡ抗體、神經(jīng)顆粒素( Ng) 抗體( 美國SANTA Cruz 公司) 、β 肌動蛋白( β-actin) 抗體、辣根過氧化物酶( HRP) 標記的二抗( 北京中杉生物公司) ; ECL 發(fā)光試劑( 美國Sigma 公司) 、Chemilmager 5500V2103( 美國) 。其他試劑均為分析純。
1. 2 動物
模型建立將60 只( AlCl3) 大鼠隨機分3 組，每組20 只。對照組用蒸餾水喂養(yǎng)，Al 暴露組分別用含有0. 2% 和0. 4%氯化鋁的蒸餾水喂養(yǎng)。動物室溫度保持在18℃ ～ 23℃、相對濕度為45% ～ 55%，光照時間12 h∶ 12 h。Al 暴露大鼠保持健康，體重為對照大鼠的( 90 ± 6) %。3 個月后，進行大鼠學習記憶的行為學及其他生化指標測定。
1. 3 Morris 水迷宮測定
大鼠學習記憶行為參考文獻的方法，Morris 水迷宮測試在內(nèi)徑180 cm、高60 cm 的圓形水池中進行。水深48 cm，水溫為( 22 ± 0. 5) ℃，水池內(nèi)放入奶粉使之成為乳白色。將水池分為西南、西北、東南和東北( SW、NW、SE和NE) 四個象限，NW 象限正中距池壁20 cm 處放置逃避平臺( 直徑約8 cm) ，平臺位于水下2 cm。水池正上方安裝帶有顯示系統(tǒng)的攝像機，計算機自動跟蹤計時并記錄游泳軌跡，實驗期內(nèi)迷宮外參照物保持不變。Morris 水迷宮實驗包括定位航行實驗和空間探索實驗兩個部分，根據(jù)相關文獻，簡單地說，實驗大鼠每天游泳4 次，分別從不同象限將動物頭朝池壁入水，并在水池上標定相同一點作為每次實驗大鼠的入水點，尋找平臺時間上限設置為120 s。如果在規(guī)定時間內(nèi)未找到平臺，由實驗者將其引導至平臺并停留30s 以加強記憶，緩解緊張情緒。逃避潛伏期記錄為120 s，每只大鼠的游泳時間間隔為15 min。觀察和記錄120 s 內(nèi)大鼠穿越平臺的次數(shù)、在原平臺象限搜索時間占總時間的百分比和在原平臺象限搜索距離占總距離的百分比，并記錄大鼠在120 s 內(nèi)搜索平臺的路線圖。空間探索實驗只進行1 次。
1. 4 腦組織和血液中Al 含量測
定根據(jù)文獻，準確分離并稱取各組大鼠海馬組織( 約0. 1 ～ 0. 5 g) 或準確吸取0. 2 ～0. 5 ml 的全血于石英燒杯中，放入聚四氟乙烯( PTFE) 中，加入5 ～ 8 ml 混酸( 硝酸∶ 高氯酸體積比為4∶ 1) ，同時做空白對照。低溫加熱至試樣全部溶解，繼續(xù)加熱蒸發(fā)至近干后加0. 2% 硝酸溶解殘留物，并以0. 2% 硝酸定容至50 ml，采用石墨爐原子吸收分光光度法測定腦鋁或血鋁含量。
1. 5 大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2 + 含量測定〔20〕冰上分離大鼠
海馬組織后，放入D-Hank 液中。37℃ 下用0. 125% 胰酶消化20 min，反復吹打后離心，制備密度為106 ～ 107 個/ml 的單細胞懸液。臺盼藍染色，確定分離出的單細胞存活率在95% 以上。將終濃度為4 μmol /L 的Fura-2 /AM 加入上述分離出來的細胞懸液中， 37℃下孵育35 min 后，用含0. 2% BSA 的Hank 液清洗殘留的Fura-2 /AM。然后，將細胞重懸于無Mg2 + 的Hank 液中( mmol /L) : HEPES 10，KCl 5. 0，NaCl 145，CaCl2 1. 3，L-glucose10，Na2HPO4。采用日立F-3000 型熒光雙波長分光光度計測定細胞Ca2 + 濃度。激發(fā)光波長設定為340 ～ 380 nm，發(fā)射光波長為510 nm。根據(jù)下面公式計算Ca2 + 濃度〔Ca2 +〕i = Kd〔( R -Rmin) /( Rmax - R) 〕( Fmin /Fmax) 。Kd 值為224 nmol /L，R 為熒光值，〔Ca2 +〕i為nmol /L，而Fmin 為加入EGTA 后測得的熒光值，F(xiàn)max 為加入TritonX-100 后測得的熒光值。
1. 6 逆轉錄實時PCR 法檢測mRNA 表達
冰上分離各組大鼠海馬組織，按照TRIzol 說明書( Invitrogen，USA) 抽提各組海馬組織的總RNA。應用紫外分光光度儀測定RNA 樣品260 /280 nm 波長處吸光度比值為1. 9 ～ 2. 0。根據(jù)試劑盒說明書要求，采用oligo ( dT) 和super script Ⅱ進行逆轉錄后，用雙標記熒光探針混合物( SYBR Green PCR Master mix) 在ABI prism7500自動序列分析系統(tǒng)( Biosystems) 中進行實時定量PCR 分析，每組重復3 次。CaMKⅡ基因引物特異序列分別為5'-AGCCATCCTCACCACTAT-3' ( 上游) 和5'-CTTCACGCCATCATTCTTC-3'( 下游) ; CREB 基因引物特異序列分別為: 5'-CCAGCCATCAGTTATTCAGT-3' ( 上游) 和5'-TTACACTATCCACAGACTCCT' ( 下游) ; β-actin 作為內(nèi)參照，其引物特異序列為5'-GAG ACC TTCAAC ACC CCA GCC-3'( 上游) 和5'-GGA TCT TCA TGA GGTAGTCA G-3'。兩種基因擴增結果用β-actin 進行標化。
1. 7 免疫印跡檢測
蛋白表達采用頸椎脫臼法處死大鼠，冰上分離大鼠海馬，剔除血管。在每個裝有海馬的離心管中，按照1∶ 9比例加入裂解液( 10 mmol /L Tris-HCl pH 7. 5，1mmol /LEDTA，1 mmol /L EGTA， 100 mmol /L NaCl， 50 mmol /L NaF，1%TritonX-100，1mmol /L Na3VO4，1mmol /L PMSF) ，1μg /ml 亮肽素，1μg /ml 抑蛋白酶( Santa Cruz，USA) ， 50 mmol /L β-glycerolphosphate，1 mmol /L 二硫蘇糖醇和0. 09% Brij-35。4℃下超聲粉碎后27 000 g 離心1. 5 h，取上清，即總蛋白提取液。BCA 蛋白定量試劑盒測定樣品蛋白濃度，取50 μg 總蛋白，采用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳( 110 V，2 h) 。待電泳完成后，把蛋白轉印至硝酸纖維素( NC) 上。分別用抗tCREB、p-CREB( Ser133) ( 1∶ 100) 、Ng( 1 ∶ 500) 、p-CaMKⅡ( 1 ∶ 500) 和β-actin( 1∶ 1 000) 抗體孵育，最后加入HRP 標記的相應二抗，ECL 發(fā)光并成像分析。
1. 8 免疫組化檢測
蛋白表達各組大鼠經(jīng)4% 多聚甲醛灌流固定后取海馬組織，30% 蔗糖( 用4% 多聚甲醛配置) 后固定48 h，冷凍切片( 40 μm/片) 。分別經(jīng)0. 3% 過氧化氫甲醇溶液、0. 3% Triton-100 處理后， 0. 01 mol /L PBS 清洗5 min × 3 次。加入一抗CaMKⅡ( 1∶ 200) 4℃孵育過夜、二抗( 1∶ 1 000) 室溫下孵育2 h、DAB 法顯色。
1. 9 統(tǒng)計學分析
應用SPSS11. 0 軟件，組間資料統(tǒng)計用單因素方差分析( ANOVA) 。采用單因素重復測量方差分析評估行為學數(shù)據(jù)。
2 結果
2. 1 慢性Al 暴露可誘導大鼠學習記憶損傷Morris 水迷宮測試結果表明，與對照組相比較，鋁暴露各組大鼠的穿越平臺次數(shù)、在原平臺象限搜索時間占總時間的百分比和在原平臺象限搜索距離占總距離的百分比顯著降低( P < 0. 05) ; 在慢性Al 暴露各組之間， 0. 4% AlCl3組大鼠穿越平臺次數(shù)和搜索距離明顯低于0. 2% AlCl3組( P < 0. 05) ，呈現(xiàn)劑量依賴性; 各組搜索時間無統(tǒng)計學差異。
2. 2 慢性Al 暴露可增加大鼠血Al 和海馬組織內(nèi)Al 的含量與對照組相比較，Al 暴露各組大鼠的血液和海馬組織中Al 含量明顯增加( P < 0. 05) ; 在Al 暴露各組大鼠之間，0. 4% AlCl3__組大鼠的血Al 和海馬組織Al 含量明顯高于0. 2% 組( P<0. 05) 。
2. 3 慢性Al 暴露可增加大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)的自由鈣離子( 〔Ca2 +〕i) 濃度與對照組相比，Al 暴露各組大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)〔Ca2 +〕i明顯增高，從( 155. 75 ± 15. 33) nmol /L( 對照組)分別增至( 515. 92 ± 53. 59 ) nmol /L ( 0. 2% AlCl3組) 和( 646. 87 ± 62. 32) nmol /L( 0. 4% AlCl3組) ; 與0. 2% AlCl3組相比， 0. 4% AlCl3組大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)〔Ca2 +〕i顯著升高( P< 0. 05) 。
2. 4 慢性Al 暴露對CaMKⅡ和CREB mRNA 表達的影響各組CaMKⅡ及CREB mRNA 表達無顯著變化( P > 0. 05) 。對照組設為1， 0. 2% AlCl3組與0. 4% AlCl3組CaMKⅡ mRNA 表達量分別為0. 98 ± 0. 21、1. 11 ± 0. 18，CREB mRNA 表達量分別為0. 99 ± 0. 19、1. 03 ± 0. 15。
2. 5 慢性Al 暴露對CaMKⅡ和CREB 總蛋白表達的影響免疫組化結果顯示，各組CaMKⅡ染色密度元顯著差異( P >0. 05) 。同時，Western 印跡結果也顯示( 圖1) ，各組CREB 總蛋白表達水平無顯著變化( P > 0. 05) ，CREB 總蛋白表達分別為0. 55 ± 0. 065 ( 對照組) 、0. 54 ± 0. 062 ( 0. 2% AlCl3組) 和0. 57 ± 0. 064( 0. 4% AlCl3組) ( P > 0. 05) 。
2. 6 慢性Al 暴露影響學習記憶關鍵蛋白分子CaMKⅡ和CREB 的活性與對照組相比，Al 暴露組大鼠海馬組織中p-CaMKⅡ、Ng 和p-CREB 表達水平均明顯降低( P < 0. 05) ; 同時，隨著Al 暴露濃度的增加，p-CaMKⅡ、Ng 和p-CREB 表達逐漸降低，呈劑量依賴性( P < 0. 05) 。
3 討論
Al 暴露因素是AD 發(fā)病機制中研究最多的環(huán)境風險因素。Al 在神經(jīng)系統(tǒng)中的蓄積可產(chǎn)生毒性作用，導致神經(jīng)元損傷，從而引起智力和認知能力的缺欠。同時，AD 患者腦Al 含量較高，神經(jīng)原纖維纏結( NTFs) 中含有高濃度的Al。因此，研究Al暴露與AD 的關系十分重要。Morris 水迷宮行為學評估結果證明，慢性Al 暴露確實可以造成大鼠的學習記憶損傷，這些結果與以往國內(nèi)外一些研究的結果相似。Ca2 + 對真核細胞的代謝及各種生理功能具有十分重要的作用，并且細胞外Ca2 + 濃度遠遠高于細胞內(nèi)Ca2 + 濃度。此外，在神經(jīng)系統(tǒng)中，Ca2 + 作為最基本的第二信使，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、調(diào)控突觸可塑性，甚至是基因表達。有研究表明，Al3 + 離子半徑與Ca2 + 相似，可以與Ca2 + 結合位點作用，從而在一定程度上影響細胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)。在體外培養(yǎng)的條件下，Al暴露后可顯著提高星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Ca2 + 濃度。我們的實驗結果證明，慢性Al 暴露可顯著提高大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)的Ca2 + 濃度，并呈劑量依賴性。此結果與慢性Al 暴露可顯著增加神經(jīng)突觸內(nèi)鈣濃度的研究結果相似。
CaMKⅡ是空間學習和記憶的分子基礎，Ca2 + 內(nèi)流可磷酸化激活CaMKⅡ，活化的CaMKⅡ從細胞質(zhì)移動到突觸并結合NMDA 型谷氨酸受體，而CaMKⅡ-NMDA 受體復合物是誘導長時程增強的關鍵分子。研究表明，在LTP 后期，CaMKⅡ具有放大并強化突觸可塑性的結構性功能。我們的結果證明，慢性Al 暴露并未影響大鼠海馬區(qū)CaMKⅡ總蛋白的表達，但是卻降低了p-CaMKⅡ的表達，說明Al 暴露可抑制CaMKⅡ的活性。Ng 是一種突觸后蛋白，可以與CaM 單體結合，對于CaMKⅡ的活性具有重要的影響。研究表明，Ng 增高可以增加CaMKⅡ激活，從而增強突觸可塑性; 而在Ng 敲除的小鼠中，CaMKⅡ的活性也明顯降低。我們的結果表明，Al 暴露可以降低大鼠海馬神經(jīng)細胞中Ng 的蛋白表達。因此，總體來說，慢性Al 暴露干擾了大鼠海馬神經(jīng)細胞的鈣穩(wěn)態(tài)，降低了p-CaMKⅡ和Ng 的蛋白表達，這可能是Al 暴露誘導學習記憶損傷、誘導AD 發(fā)病的機制之一。
CREB 是一種分子量為43 kD 的核轉錄因子蛋白，對于神經(jīng)突觸可塑性長時間的改變具有十分重要的作用。CREB上的絲氨酸( Ser) 133 是許多蛋白激酶的作用靶點，例如CaMKⅡ和Ⅳ、蛋白激酶A 和蛋白激酶C 等。一旦Ser-133 位點被磷酸化，CRE 介導的轉錄即刻啟動，從而最終激發(fā)LTP 相關蛋白的合成。本結果證明，慢性Al 暴露顯著抑制p-CREB( S133) 的表達，但是CREB 總蛋白表達未受到顯著影響。這可能是由于p-CaMKⅡ蛋白的降低抑制了CREB( S133) 磷酸化過程。綜上所述，本文結果表明慢性Al 暴露損傷了大鼠的學習記憶能力，這可能是由于Al 暴露造成了海馬神經(jīng)細胞內(nèi)鈣離子紊亂，從而抑制了CaMKⅡ/CREB 通路。除此之外，Al 暴露還抑制了海馬神經(jīng)細胞的Ng 蛋白表達，進一步抑制了CaMKⅡ的激活。
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