最新藥學(xué)專業(yè)畢業(yè)論文開題報(bào)告

　　畢業(yè)論文題目：梓醇對D-半乳糖擬老化神經(jīng)元的作用研究

　　背景介紹:

　　隨著世界人口中老年人比例和絕對數(shù)量的不斷攀升，由衰老引起的人口老化相關(guān)疾病的發(fā)病率明顯升高，與衰老相關(guān)的疾病已成為科學(xué)家面臨的一項(xiàng)重要挑戰(zhàn)。由于這類疾病常伴有嚴(yán)重的認(rèn)知障礙及精神異常癥狀，甚至癱瘓和感覺障礙[1]，嚴(yán)重危害著老年人的健康，同時(shí)也給家庭、社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。因此探討腦衰老機(jī)制，研究有效的延緩衰老進(jìn)程的藥物，防治老年疾病己成為當(dāng)今社會(huì)和醫(yī)藥學(xué)界研究的重大課題。

　　在諸多老年性疾病中，神經(jīng)退行性疾病患病率逐年提高，已經(jīng)成為影響人們健康水平和生活質(zhì)量的重大社會(huì)問題。神經(jīng)退行性疾病是中樞系統(tǒng)神經(jīng)組織非正常退變引起的一類進(jìn)行性功能缺陷與衰退疾病，如阿爾茨海默病(老年癡呆)，帕金森病，肌萎縮側(cè)索硬化癥，亨廷頓氏舞蹈癥等[2-4]。其中，老年癡呆的患病率占老年人口的4.6%，其中半數(shù)為老年原發(fā)性退行性癡呆。流行病學(xué)調(diào)查也顯示，在65歲以上的人群中，老年原發(fā)性退行性癡呆的發(fā)病率達(dá)2.9%。該病具有復(fù)雜的病理生理過程，受基因調(diào)控和多種環(huán)境因素影響，是一類病因?qū)W和發(fā)病機(jī)制還不清楚的疾病。臨床上,對于這類疾病尚無有效控制病程進(jìn)展的措施,患者最終將喪失生活能力甚至死亡。目前，我國人口老化速度居世界之首，老年人口已超過1億，因此尋求有效的預(yù)防和治療衰老疾病的藥物迫在眉睫。

　　我國中藥有著悠久的歷史，良好的治療效果，是中華民族傳統(tǒng)文化的燦爛瑰寶，在幾千年的實(shí)踐發(fā)展中，已形成了自己獨(dú)特的理論體系。特別是針對疑難病和慢性病，中醫(yī)藥更有它的獨(dú)到之處。中藥具有多靶點(diǎn)多效性特點(diǎn)，既可改善癥狀以治標(biāo)，又可提高機(jī)體抗病能力以治本，而且副作用較少、藥源豐富。中醫(yī)在治療老年性癡呆與記憶減退的數(shù)千年臨床經(jīng)驗(yàn)中積累了許多寶貴的知識(shí)。自20世紀(jì)80年代以來，由于化學(xué)藥品開發(fā)所存在的技術(shù)難度高、價(jià)格昂貴、毒副作用明顯和環(huán)境污染嚴(yán)重等實(shí)際問題，傳統(tǒng)中醫(yī)藥的研究受到了廣泛的關(guān)注。

　　地黃是常用的補(bǔ)益中藥，為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libsch的新鮮根莖或干燥塊根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品[5]。地黃在我國有1000多年的藥用歷史，應(yīng)用十分廣泛，對免疫、血液、內(nèi)分泌、心腦血管、神經(jīng)系統(tǒng)及抗菌、抗炎等方面均有一定的作用[6]。單味地黃[7]和以地黃為主的復(fù)方在衰老及其相關(guān)疾病治療中的應(yīng)用歷史也十分久遠(yuǎn)�，F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其主要的活性組分為環(huán)烯醚萜苷類和地黃糖類。

　　梓醇是地黃中含量最高的的環(huán)烯醚萜苷類，屬于環(huán)氧醚型單萜類化合物。目前本實(shí)驗(yàn)室分別在細(xì)胞和動(dòng)物水平上證明了梓醇具有神經(jīng)保護(hù)作用，可能是潛在的延緩衰老和治療神經(jīng)退行性疾病如老年癡呆、帕金森疾病的藥物。由于衰老是各種神經(jīng)退行性疾病發(fā)生的根本要素，研究梓醇的抗衰老作用對預(yù)防和治療該類疾病具有重要意義[8-9]。

　　實(shí)驗(yàn)前期發(fā)現(xiàn)梓醇具有改善D-半乳糖致衰老模型小鼠記憶減退的功效，同時(shí)能提高腦組織抗氧化能力和能量代謝障礙,因此本研究利用D-半乳糖引起神經(jīng)元老化的模型進(jìn)一步研究梓醇抗衰老的作用機(jī)制，為該藥的開發(fā)和臨床應(yīng)用奠定一定的基礎(chǔ)。

　　研究意義:

　　1、D-半乳糖致衰老神經(jīng)細(xì)胞模型鮮見報(bào)道，明確該模型作用機(jī)制有助于利用此模型進(jìn)行抗衰老藥物的篩選和機(jī)理研究。

　　2、梓醇在衰老動(dòng)物模型上的效果明顯，利用細(xì)胞模型的研究有助于闡明梓醇抗衰老作用的分子作用機(jī)制。

　　研究內(nèi)容:

　　采用小鼠腦神經(jīng)元細(xì)胞原代培養(yǎng),以D-半乳糖誘導(dǎo)體外神經(jīng)元細(xì)胞衰老,并通過研究藥物梓醇的加入對神經(jīng)元細(xì)胞的作用,進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡等綜合指標(biāo)的測定。

　　實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)用細(xì)胞免疫組化染色和熒光染色技術(shù)、流式細(xì)胞儀、熒光顯微鏡、紫外分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀等方法手段，研究梓醇在體外的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。

　　預(yù)期達(dá)到的成果和水平:梓醇對D-半乳糖引起的小鼠腦神經(jīng)元細(xì)胞衰老有保護(hù)作用.

　　因此本課題擬利用原代培養(yǎng)SD大鼠乳鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞，從超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期分析及SA-β-半乳糖苷酶(Senescence associated β-galactosidase)化學(xué)染色等指標(biāo)觀察D-半乳糖培養(yǎng)對神經(jīng)元擬老化反應(yīng)并從生化方面研究梓醇的抗老化作用。

　　研究重點(diǎn)難點(diǎn):

　　1、掌握原代神經(jīng)元細(xì)胞的培養(yǎng)、免疫組織化學(xué)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

　　2、明確D-半乳糖致神經(jīng)元衰老的作用濃度和作用時(shí)間范圍。

　　3、初步研究D-半乳糖致神經(jīng)元衰老的作用機(jī)理。

　　4、明確梓醇對D-半乳糖致衰老神經(jīng)元的作用效果。

 

 

　　課題名稱 HPLC法測定伏立諾他有關(guān)物質(zhì)和含量的研究

　　[研究的主要目的和意義]

　　vorinostat (商品名Zolinza) 是Merck 公司開發(fā)的世界上第一個(gè)抑制組蛋白脫乙�；�酶( his2tone deacetylase ,HDAC) 的新型抗癌藥物,該藥于2006 年10 月6 日獲得美國FDA 批準(zhǔn)上市,用于其他藥物治療時(shí)或治療后仍不能治愈、或惡化、或病情反復(fù)情況下的轉(zhuǎn)移性皮膚T 淋巴細(xì)胞瘤。vorinostat 化學(xué)名: N-羥基-N苯基辛二酰胺;英文名: N-hydroxy-N-phenyloctane-diamide

　　vorinostat 屬于組蛋白去乙酰化酶抑制劑類抗腫瘤藥物,低濃度( IC50 < 86 nmol·L - 1) 即可以有效抑制組蛋白脫乙酰酶HDAC1 、HDAC2 、HDAC3 和HDAC6 的活性,抑制組蛋白次乙�；�,因而從基因水平調(diào)控細(xì)胞周期,阻斷癌細(xì)胞基因復(fù)制,并激活其凋亡基因,達(dá)到抑制和殺滅癌細(xì)胞的效果。但vorinostat 的抗癌機(jī)制仍在深入研究之中,其具體作用機(jī)制尚不完全清楚[6 - 7 ] 。兩項(xiàng)臨床試驗(yàn)證明了vorinostat 的安全性和有效性,其中包括107 名接受其他藥物治療后又復(fù)發(fā)的CTCL 患者。按皮膚損傷改善標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分等級(jí)的判斷,接受Zolinza 治療的患者中30 %有所改善,療效平均持續(xù)168 d。

　　一些生物學(xué)數(shù)據(jù)已經(jīng)證明了vorinostat 在皮膚癌，前列腺癌治療中的有效性。而且近年研究vorinostat 不僅可以單獨(dú)作為腫瘤治療藥物,還可以與其它抗癌藥物聯(lián)合用藥, 減少對正常細(xì)胞的毒性,具有增效作用。可與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(如52 雜氮22′2 脫氧胞苷、視黃酸、mRNA 轉(zhuǎn)錄抑制劑flavopiridol)[51- 53] 、凋亡受體配體(如阿霉素、長春新堿、依托泊苷、多烯紫杉醇)[54- 56]、化療藥物(如抗代謝藥吉西他賓、全反式維甲酸) [57,58]以及激酶抑制劑、放射線等聯(lián)合用藥。近年來研究發(fā)現(xiàn)vorinostat

　　還可影響到有絲分裂、DNA 復(fù)制和修復(fù)以及調(diào)控非組蛋白的蛋白質(zhì)乙�；�程度。但是該藥用于臨床治療癌癥仍然需要解決一些問題如: 抑制劑對HDAC 酶系的選擇識(shí)別作用、選擇最佳藥用劑量、治療周期以及尋找更多可以促進(jìn)這種藥抑制作用的物質(zhì)等。毋庸置疑,隨著對HDACIs 抗癌機(jī)理的深入研究,vorinostat 將會(huì)有廣闊的應(yīng)用前景。

　　伏諾立他目前在國內(nèi)還沒有上市，我們準(zhǔn)備仿制該品種，建立該藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，用建立的標(biāo)準(zhǔn)對原料和制劑進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)和主藥含量進(jìn)行研究。

　　[采用的研究手段及文獻(xiàn)綜述]

　　根據(jù)破壞試驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)合伏立諾他合成工藝，建立伏立諾他有關(guān)物質(zhì)檢查方法，并對其進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。

　　1.儀器與藥品

　　Waters 996光電二極管陣列檢測器，Waters Empower色譜工作站，試藥及其中間體均由南京海納醫(yī)藥科技公司提供

　　2. 色譜條件的建立

　　2.1檢測波長的選擇

　　取伏立諾他適量,用流動(dòng)相制成每1ml含15μg的溶液,照分光光度法(中國藥典2005年版二部附錄Ⅳ A)在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描測定

　　2.2系統(tǒng)使用性試驗(yàn)

　　色譜柱:Diamonsil C18 ( 250 mm ×4. 6 mm, 5μm)色譜柱為分析柱;乙腈- 0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)PH3.0)為流動(dòng)相，不斷調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，梯度洗脫，流速為1.0 ml ·min- 1 , 檢測波長為241nm, 柱溫30℃, 進(jìn)樣量: 20μl。

　　根據(jù)合成工藝,伏諾立他成藥中可能引入一系列的合成中間體及原料還有雜質(zhì)，取本品可能帶入的雜質(zhì)、中間體分別加流動(dòng)相適量溶解;另取雜質(zhì)中間體及伏立諾他適量,用流動(dòng)相制成適宜濃度的溶液,精密

　　吸取雜質(zhì)，中間體與吡非尼酮混合溶液各20 μl,分別進(jìn)樣，考察分離度，理論塔板數(shù)，及拖尾因子，再根據(jù)具體條件進(jìn)行調(diào)整，選出最適合的條件。

　　2.3專屬性試驗(yàn)

　　取供試品,進(jìn)行高溫、光照、酸、堿、氧化破壞試驗(yàn)。

　　熱降解溶液的配制:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,置140℃高溫4 h后,用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度; 光降解溶液的配制:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,用流動(dòng)相制成每1 ml含吡非尼酮0. 8 mg的溶液,置紫外燈光下48 h;

　　酸降解溶液的配制:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,加2mol·L - 1鹽酸溶液5 ml,放置4 h,用2 mol·L - 1氫氧化鈉溶液調(diào)至中性,加流動(dòng)相稀釋定容;

　　堿降解溶液的配制:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,加2mol·L - 1氫氧化鈉溶液放置4 h,溶液顏色變黃,另加2 mol·L - 1鹽酸溶液調(diào)至中性,加流動(dòng)相稀釋定容;

　　氧化破壞溶液的配制:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,加過氧化氫5 ml,避光放置4 h,用流動(dòng)相稀釋定容。照高效液相色譜法,取上述各溶液各20μl進(jìn)樣,記錄結(jié)果，進(jìn)行分析

　　2.4線性范圍：

　　精密稱取伏立諾他對照品約15 mg,置50ml量瓶中,加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為貯備液。分別精密量取貯備液1、2、3、4、5 ml置10 ml量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻。分別取溶液20μl分別注入色譜儀,記錄色譜圖,量取峰面積,由溶液濃度(C) 對峰面積(A)線性回歸。

　　2.5檢測限：取空白基線一段,計(jì)算其噪音峰高,再將伏立諾他樣品溶液用流動(dòng)相稀釋適當(dāng)濃度進(jìn)樣,使其峰高為噪音峰高的3倍,記錄檢測限。

　　2.6精密度試驗(yàn)

　　2.6.1 進(jìn)樣精密度：取標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下高、中、低三種濃度的溶液,分別重復(fù)進(jìn)樣5 次,以峰面積來考察精密度。

　　2.6.2中間精密度：選擇不同人員,分別測定同一批樣品的含量。

　　2.7重復(fù)性試驗(yàn)：分別取同一批樣品, 6份,精密稱定,照樣品測定項(xiàng)下操作,計(jì)算含量。

　　2.8穩(wěn)定性試驗(yàn)：照標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法配制高、中、低三種濃度 的溶液,分別于0、1、2、4、6、8 h測定。考察其穩(wěn)定性

　　2.9含量測定：取本品適量,精密稱定,用流動(dòng)相制成每1ml含50μg的溶液,作為供試品溶液,精密量取20μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取峰面積;另取經(jīng)干燥至恒重的伏立諾他對照品適量,同法測定,按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算,即得。

　　2.10有關(guān)物質(zhì)測定：取本品適量,精密稱定,用流動(dòng)相制成每1 ml含0.5mg的溶液,作為供試品溶液;精密量取供試品溶液1 ml,置100 ml量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液。精密量取對照溶液20μl,注入液相色譜儀,調(diào)節(jié)檢測靈敏度,使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10% ～25%;再精密量取供試品溶液和對照溶液各20μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的4倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰,最大單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液主峰面積的1 /2 ( 0.5% ) ,各雜質(zhì)峰面積總和,不得大于對照溶液主峰面積( 1% )。

　　參考文獻(xiàn)：

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