藥學大專畢業(yè)論文開題報告

　　課題名稱 HPLC法測定伏立諾他有關物質和含量的研究

　　[研究的主要目的和意義]

　　vorinostat (商品名Zolinza) 是Merck 公司開發(fā)的世界上第一個抑制組蛋白脫乙�；�酶( his2tone deacetylase ,HDAC) 的新型抗癌藥物,該藥于2006 年10 月6 日獲得美國FDA 批準上市,用于其他藥物治療時或治療后仍不能治愈、或惡化、或病情反復情況下的轉移性皮膚T 淋巴細胞瘤。vorinostat 化學名: N-羥基-N苯基辛二酰胺;英文名: N-hydroxy-N-phenyloctane-diamide

　　vorinostat 屬于組蛋白去乙酰化酶抑制劑類抗腫瘤藥物,低濃度( IC50 < 86 nmol·L - 1) 即可以有效抑制組蛋白脫乙酰酶HDAC1 、HDAC2 、HDAC3 和HDAC6 的活性,抑制組蛋白次乙�；�,因而從基因水平調控細胞周期,阻斷癌細胞基因復制,并激活其凋亡基因,達到抑制和殺滅癌細胞的效果。但vorinostat 的抗癌機制仍在深入研究之中,其具體作用機制尚不完全清楚[6 - 7 ] 。兩項臨床試驗證明了vorinostat 的安全性和有效性,其中包括107 名接受其他藥物治療后又復發(fā)的CTCL 患者。按皮膚損傷改善標準評分等級的判斷,接受Zolinza 治療的患者中30 %有所改善,療效平均持續(xù)168 d。

　　一些生物學數據已經證明了vorinostat 在皮膚癌，前列腺癌治療中的有效性。而且近年研究vorinostat 不僅可以單獨作為腫瘤治療藥物,還可以與其它抗癌藥物聯合用藥, 減少對正常細胞的毒性,具有增效作用�？膳c轉錄調節(jié)因子(如52 雜氮22′2 脫氧胞苷、視黃酸、mRNA 轉錄抑制劑flavopiridol)[51- 53] 、凋亡受體配體(如阿霉素、長春新堿、依托泊苷、多烯紫杉醇)[54- 56]、化療藥物(如抗代謝藥吉西他賓、全反式維甲酸) [57,58]以及激酶抑制劑、放射線等聯合用藥。近年來研究發(fā)現vorinostat

　　還可影響到有絲分裂、DNA 復制和修復以及調控非組蛋白的蛋白質乙�；�程度。但是該藥用于臨床治療癌癥仍然需要解決一些問題如: 抑制劑對HDAC 酶系的選擇識別作用、選擇最佳藥用劑量、治療周期以及尋找更多可以促進這種藥抑制作用的物質等。毋庸置疑,隨著對HDACIs 抗癌機理的深入研究,vorinostat 將會有廣闊的應用前景。

　　伏諾立他目前在國內還沒有上市，我們準備仿制該品種，建立該藥的質量標準，用建立的標準對原料和制劑進行有關物質和主藥含量進行研究。

　　[采用的研究手段及文獻綜述]

　　根據破壞試驗的結果，結合伏立諾他合成工藝，建立伏立諾他有關物質檢查方法，并對其進行方法學驗證。

　　1.儀器與藥品

　　Waters 996光電二極管陣列檢測器，Waters Empower色譜工作站，試藥及其中間體均由南京海納醫(yī)藥科技公司提供

　　2. 色譜條件的建立

　　2.1檢測波長的選擇

　　取伏立諾他適量,用流動相制成每1ml含15μg的溶液,照分光光度法(中國藥典2005年版二部附錄Ⅳ A)在200～400 nm波長范圍內掃描測定

　　2.2系統(tǒng)使用性試驗

　　色譜柱:Diamonsil C18 ( 250 mm ×4. 6 mm, 5μm)色譜柱為分析柱;乙腈- 0.1%磷酸溶液(三乙胺調PH3.0)為流動相，不斷調節(jié)流動相比例，梯度洗脫，流速為1.0 ml ·min- 1 , 檢測波長為241nm, 柱溫30℃, 進樣量: 20μl。

　　根據合成工藝,伏諾立他成藥中可能引入一系列的合成中間體及原料還有雜質，取本品可能帶入的雜質、中間體分別加流動相適量溶解;另取雜質中間體及伏立諾他適量,用流動相制成適宜濃度的溶液,精密

　　吸取雜質，中間體與吡非尼酮混合溶液各20 μl,分別進樣，考察分離度，理論塔板數，及拖尾因子，再根據具體條件進行調整，選出最適合的條件。

　　2.3專屬性試驗

　　取供試品,進行高溫、光照、酸、堿、氧化破壞試驗。

　　熱降解溶液的配制:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,置140℃高溫4 h后,用流動相溶解并稀釋至刻度; 光降解溶液的配制:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,用流動相制成每1 ml含吡非尼酮0. 8 mg的溶液,置紫外燈光下48 h;

　　酸降解溶液的配制:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,加2mol·L - 1鹽酸溶液5 ml,放置4 h,用2 mol·L - 1氫氧化鈉溶液調至中性,加流動相稀釋定容;

　　堿降解溶液的配制:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,加2mol·L - 1氫氧化鈉溶液放置4 h,溶液顏色變黃,另加2 mol·L - 1鹽酸溶液調至中性,加流動相稀釋定容;

　　氧化破壞溶液的配制:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,加過氧化氫5 ml,避光放置4 h,用流動相稀釋定容。照高效液相色譜法,取上述各溶液各20μl進樣,記錄結果，進行分析

　　2.4線性范圍：

　　精密稱取伏立諾他對照品約15 mg,置50ml量瓶中,加流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為貯備液。分別精密量取貯備液1、2、3、4、5 ml置10 ml量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻。分別取溶液20μl分別注入色譜儀,記錄色譜圖,量取峰面積,由溶液濃度(C) 對峰面積(A)線性回歸。

　　2.5檢測限：取空白基線一段,計算其噪音峰高,再將伏立諾他樣品溶液用流動相稀釋適當濃度進樣,使其峰高為噪音峰高的3倍,記錄檢測限。

　　2.6精密度試驗

　　2.6.1 進樣精密度：取標準曲線項下高、中、低三種濃度的溶液,分別重復進樣5 次,以峰面積來考察精密度。

　　2.6.2中間精密度：選擇不同人員,分別測定同一批樣品的含量。

　　2.7重復性試驗：分別取同一批樣品, 6份,精密稱定,照樣品測定項下操作,計算含量。

　　2.8穩(wěn)定性試驗：照標準曲線項下的方法配制高、中、低三種濃度 的溶液,分別于0、1、2、4、6、8 h測定�？疾炱浞�(wěn)定性

　　2.9含量測定：取本品適量,精密稱定,用流動相制成每1ml含50μg的溶液,作為供試品溶液,精密量取20μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取峰面積;另取經干燥至恒重的伏立諾他對照品適量,同法測定,按外標法以峰面積計算,即得。

　　2.10有關物質測定：取本品適量,精密稱定,用流動相制成每1 ml含0.5mg的溶液,作為供試品溶液;精密量取供試品溶液1 ml,置100 ml量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液。精密量取對照溶液20μl,注入液相色譜儀,調節(jié)檢測靈敏度,使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10% ～25%;再精密量取供試品溶液和對照溶液各20μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主成分峰保留時間的4倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質峰,最大單個雜質峰面積不得大于對照溶液主峰面積的1 /2 ( 0.5% ) ,各雜質峰面積總和,不得大于對照溶液主峰面積( 1% )。

　　參考文獻：

　　【1】胡 楊，陳國華，吳 燕，楊尚彥.伏諾立他的合成[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2009，40(7)：481-482.

　　【2】黃小平，徐江. 組蛋白去乙�；�酶抑制劑類抗癌藥Vorinostat[J].化工中間體，2009，06：11-13.

　　【3】Sakajiri S, Kumagai T, Kawamata N, et al. Histone deacetylase inhibitors profoundly decrease proliferation of human lymphoid cancer cell lines [J]. Exp Hematol, 2005,33(1): 53-61.

　　【4】Robert A.Parise, Julianne L.Holleran, Jan H.Beumera, Suresh Ramalingama, Merrill J. Egorin. A liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometric assay for quantitation of the histone deacetylase inhibitor, vorinostat (suberoylanilide hydroxamicacid, SAHA),and its metabolites in human serum[J]. Chromatography B, 840 (2006) 108

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