近期色譜質(zhì)譜相關(guān)技術(shù)和方法學(xué)研究綜述論文
本文對近期色譜-質(zhì)譜相關(guān)技術(shù)和方法學(xué)研究進展進行簡略評述。由于色譜方法研究和應(yīng)用領(lǐng)域十分廣泛，涉及方方面面，本文僅簡要介紹色譜、多維色譜及其與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在生物物質(zhì)分析領(lǐng)域（主要是人類染色體蛋白質(zhì)組、糖蛋白、磷酸化蛋白質(zhì)組）的研究工作，此外還包括體積排阻色譜分離病毒顆粒、量子點、肝素方面的研究和多維氣相色譜分析進展及其他亮點文章。
最近有專輯[1]報道了人類染色體蛋白質(zhì)組的研究。人類染色體蛋白組計劃（CHPP）的目標(biāo)瞄準(zhǔn)人類基因組編碼的 19 467 個蛋白質(zhì)，鑒定其中盡可能多的蛋白質(zhì)。從過去的 4 年來看，該蛋白質(zhì)組計劃獲得的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)從 2013 年的 13 664 個逐年增加到 2016 年的16 537個高置信度蛋白質(zhì)。該數(shù)據(jù)經(jīng)過了嚴格的人類蛋白質(zhì)組計劃質(zhì)譜數(shù)據(jù)解析標(biāo)準(zhǔn)（2. 14 版）的驗證。人類基因組預(yù)測的蛋白質(zhì)中，85% 已得到質(zhì)譜和多重方法的確認，那些還沒有得到驗證的丟失蛋白質(zhì)（missing proteins）仍然在持續(xù)發(fā)現(xiàn)之中，其中 2 663 個丟失蛋白質(zhì)的線索正在通過國際數(shù)據(jù)庫 PeptidesAtlas 重新分析。
糖蛋白有重要作用，例如改變蛋白質(zhì)功能、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用和蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)率，而糖鏈結(jié)構(gòu)與疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其中非正常序列結(jié)構(gòu)是疾病或癌癥的關(guān)鍵標(biāo)志物。Zhou 等[2]發(fā)展了糖蛋白的定量標(biāo)記新方法，采用 aminoxy TMT（aminoxytandem mass tag）標(biāo)記試劑，同時編碼標(biāo)記定量 6種糖鏈結(jié)構(gòu)的糖蛋白，用 0. 2 mol/ L NaCl 溶液顯著增強鈉加合物的離子化效率。經(jīng)過色譜分離與質(zhì)譜條件的優(yōu)化，作者分離檢測了血清中的少量 N-糖鏈，確定了該方法在食管疾病中的診斷作用。
相對分子質(zhì)量較大的多肽鑒定一直是一項困難的工作，由于其不能酶解、電荷少，鑒定比較困難。近期，Lin 等[3]報道了一種納流高效液相色譜-質(zhì)譜分析方法，分離鑒定高相對分子質(zhì)量的糖肽。該方法發(fā)展了一種超強離子化試劑硝基芐醇（m-NBA），將其加入流動相中可顯著增強相對分子質(zhì)量較大的，特別是酸性糖基化肽的電離效果。含有唾液酸的糖肽提高效果尤其明顯。通過對生物工程在大腸桿菌中表達的糖蛋白的分析，鑒定到的糖肽含有 98個單糖的糖鏈結(jié)構(gòu)。驗證了反相液相色譜流動相中添加 m-NBA 可有效增強糖蛋白的鑒定效果。
Shubhakar 等[4]報道了一種糖鏈全甲基化的高通量鑒定方法，該方法經(jīng)過自動化的流程對糖鏈進行全甲基化處理，平均每分鐘完成一個樣品的分析。對免疫球蛋白（IgG4）單克隆抗體和重組人紅細胞生成素（rhEPO）的分析驗證了方法的可靠性。通過親水作用色譜和超高效液相色譜分析驗證了方法的準(zhǔn)確性，其有望在藥物篩選和臨床標(biāo)志物研究等方面獲得應(yīng)用。
Tanabe 等[5]開展了多巖藻糖化蛋白與肝癌的相關(guān)性研究。研究發(fā)現(xiàn)早期的肝癌不僅與甲胎蛋白（AFP）的異常升高相關(guān)，還與多巖藻糖化的 α-1-酸糖蛋白有密切關(guān)系。對 27 例乙肝、26 例丙肝、27 例健康志愿者血液中的糖蛋白組進行分析，采用超濾和凝集素親和色譜處理、色譜-質(zhì)譜分離鑒定，在 3萬多糖肽中篩選出了 α-1-酸糖蛋白分子，該分子具有多個巖藻糖結(jié)構(gòu)和四天線結(jié)構(gòu)，在乙肝和丙肝導(dǎo)致的肝癌病人的血液樣本中異常升高。
Karner 等[6]研究了黏膜炎莫拉菌，它通過膜蛋白黏附在人的呼吸道上皮細胞上，感染形成慢性阻塞性肺病和急性中耳炎等疾病。作者采用碳酸鈉溶液提取外層質(zhì)膜泡囊，通過納流液相色譜、多維色譜-質(zhì)譜進行分離鑒定。氨基葡萄糖糖苷（GAGs）在侵入人體細胞時發(fā)揮著關(guān)鍵作用，作者重點對GAGs 親和的膜蛋白組進行了研究，發(fā)現(xiàn)了潛在的抗原蛋白組和疫苗結(jié)合蛋白質(zhì)。同時，還發(fā)現(xiàn)了一批新的潛在免疫抗原蛋白質(zhì)。
磷酸化蛋白在生命調(diào)控過程中的作用非常廣泛，其分離鑒定研究仍然十分活躍。Zarei等[7]研究發(fā)展了基于靜電排斥-親水作用色譜（ERLIC）分離磷酸化肽的新方法。第一步，多磷酸化肽根據(jù)其負電荷多少在離子排斥-親水作用模式下依次分離；第二步，強陽離子交換（SCX）色譜再次分離單磷酸化肽。鑒于 SCX 色譜的交換能力較強，可以分離那些單磷酸化肽和少數(shù)負電荷少的肽，使各種磷酸化肽組分得到更完全的分離和鑒定。該方法還可以通過固相萃取柱在 2 h 內(nèi)實現(xiàn)餾分化分級。
鹽和 pH 是目前離子交換色譜的主要淋洗方式，Adachi 等[8]研究開發(fā)了一種酸梯度洗脫分離磷酸化肽的新方法。作者采用 C18-SCX StageTip 為分離介質(zhì)，分別對比了酸和鹽梯度洗脫的效果。實驗表明，采用酸梯度洗脫能從 2 mg 樣品中分離鑒定到 22 000 個磷酸化肽，比傳統(tǒng)方法獲得更多的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果，而且方法簡單、成本低、易自動化、無需復(fù)雜的技術(shù)設(shè)備。
與蛋白質(zhì)組研究密切相關(guān)的、多維色譜分離基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)譜檢測定量技術(shù)得到不斷發(fā)展。Ruedi Aebersold 研 究 組[9]發(fā) 展 了 SWATH-MS（sequential windowed acquisition of all theoreti-cal fragment ion mass spectra）技術(shù)，大幅提高了蛋白組分析的通量和重復(fù)性。近期，他們[9]又推出了用于蛋白質(zhì)組定量的 TRIC（Transfer of Identifi-cation Confidence）軟件技術(shù)。通過質(zhì)譜碎片離子數(shù)據(jù)構(gòu)建交叉校正方法，采用連續(xù)峰提取定量獲得更加準(zhǔn)確的定量結(jié)果。TRIC 技術(shù)能夠得到更加精確的`數(shù)據(jù)，校正點不超過 3 個即可解決色譜出峰過程中的濃度非均勻性問題。人誘導(dǎo)干細胞的蛋白組分析結(jié)果表明，不經(jīng)校正即可自動分析、定量輕/ 重同位素標(biāo)記的不同蛋白質(zhì)組中數(shù)千種蛋白質(zhì)峰對。
在定量蛋白質(zhì)組研究方面的常用定量軟件MaxQuant 近期又有新的技術(shù)升級[10],其中包括提供不同定量方法、控制最小假陽性率（FDRs），以及翻譯后修飾（PTMs）分析等功能。該軟件可以網(wǎng)上免費獲�。╤ttp:// www.maxquant.org）。
體積排阻色譜在分離大的生物分子和顆粒物方面具有特殊作用。Vajda 等[11]研究了體積排阻色譜（SEC）分離流感病毒顆粒的新方法。血凝反應(yīng)檢測是廣泛用于流感活性檢測的方法，但是它不能觀察到病毒顆粒大小。SEC 分離基礎(chǔ)上的檢測便可以獲 得 相 關(guān) 的 重 要 信 息。流 動 相 中 添 加 200mmol / L 的精氨酸或氯化鈉可以獲得完全分散的病毒顆粒，檸檬酸鈉則可以導(dǎo)致病毒聚集。H1N1 病毒的數(shù)量與 DNA 含量在 5 ng/ mL 到 670 ng/ mL 之間有很好的關(guān)聯(lián)度。餾分中病毒含量得到紅細胞凝聚活性測定的驗證。3 種流感疫 苗 株 （H1N1v5258、H1N1 PR / 8 / 34 和 H3N2 Aichi / 2 / 68）依據(jù)病毒顆粒的大小經(jīng)過 SEC 分離和活性檢測，獲得了更重要的病毒相關(guān)信息。
量子點（QD）納米材料廣泛用于生物分子熒光標(biāo)記跟蹤和細胞成像等。龐代文實驗室[12]采用SEC 發(fā)展了量子點分離純化技術(shù)。作者采用高效SEC 對辛胺接枝聚丙烯酸修飾的量子點進行分離，將量子點與團聚量子點和聚合物分開；分離后的量子點穩(wěn)定性大幅增加。隨后，作者對量子點、量子點與鏈霉親和素（SA）和免疫球蛋白（IgG）分別結(jié)合形成復(fù)合物 QD-SA 和 QD-IgG 進行分離，并將分離制備的兩種復(fù)合物用于腫瘤標(biāo)志物的切片檢測，效果非常好，無非特異性吸附現(xiàn)象。該方法對生物探針的制備、分離、純化有重要的應(yīng)用價值。
Zaia 等[13]采用體積排阻色譜-離子抑制質(zhì)譜分離檢測了低分子量肝素類化合物的成分。肝素作為重要的治療藥物，一直被廣泛應(yīng)用于治療凝血功能障礙。隨著國際專利過期，應(yīng)用肝素制備的新藥已經(jīng)獲得美國 FDA（Food and Drug Administration）批準(zhǔn)。作者發(fā)展了針對含有 30 個以內(nèi)寡糖并具有精確相對分子質(zhì)量的肝素類化合物單體測定方法，采用離子抑制池除鹽，體積排阻色譜餾分直接用電噴霧質(zhì)譜鑒定，可以圓滿解決肝素的分析問題。
全二維氣相色譜（GC×GC）技術(shù)研究也有不少新進展。Luong 等[14]發(fā)展了新的 GC×GC 系統(tǒng)，采用了不依賴溫度的調(diào)制調(diào)節(jié)器（TiM）。該系統(tǒng)采用熱電制冷和云母制熱技術(shù)，無需液氮冷凍，增大補充氣流可以有效改善色譜操作參數(shù)，有利于分別控制第一維和第二維色譜柱達到最佳分離效率。調(diào)節(jié)再進樣效率還有利于第一維色譜的反吹，加快消除柱子的背景干擾。TiM 技術(shù)可用于 nC6~ nC24 范圍的揮發(fā)性化合物的分析。對苯、甲苯、乙苯和二甲苯的測定結(jié)果表明，第一維和第二維結(jié)果的重復(fù)性分別達到 0. 009% 和 0. 008% （n = 10），標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于 4. 7%.
Tian 等[15]研究開發(fā)了用于 GC×GC/ time offlight （TOF）-MS 的數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)（GC2MS）。該系統(tǒng)基于網(wǎng)絡(luò)平臺開發(fā)，可以有效利用網(wǎng)上數(shù)據(jù)信息，特別是代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，能獲得各種 GC×GC/TOF-MS 質(zhì)譜圖譜數(shù)據(jù)信息。通過比較圖譜的相似性、校正基線獲得圖譜的關(guān)聯(lián)度。GC2MS 可用于不同條件下人血漿樣品中當(dāng)歸中化合物的分析，表明該數(shù)據(jù)系統(tǒng)具有高效性和實用性。
Zimmermann 實驗室[16]采用 GC×GC 技術(shù)研究了人呼出氣體中的揮發(fā)性有機物。利用真空紫外吸收光譜（VUV）檢測化合物類型。系統(tǒng)優(yōu)化了吸收池體積和氣體流速，取得了高靈敏度和高分辨率。同時，將 VUV 檢測器與 TOF-MS 進行了比較，其峰寬達到 300 ms,檢出限達到 ng 以下級別。采用針頭捕集微萃取（NTME）采樣，測定了人血糖變化過程中呼出氣體的組成變化，對臨床應(yīng)用具有重要意義。
在色譜柱制備技術(shù)方面，Lincoln 等[17]近期研究了基于兩維“柱狀”陣列的色譜分離系統(tǒng)。采用多孔二氧化硅層增加比表面積，降低相比，提高色譜保留能力。柱狀填料多孔層厚 20~250 nm,采用光刻和等離子增強化學(xué)氣相沉積法制備，再采用十八烷基三氯硅烷或正丁基二甲基氯硅烷鍵合反應(yīng)制備反相表面。理論計算表明，50 nm 厚的多孔層可提高比表面積 120 倍。實際樣品的保留測試也表明，隨著多孔層厚度的增加，樣品的保留顯著增大。對熒光衍生的胺類化合物的兩維分離驗證了該平面色譜的高效分離能力。
Jorgenson 研究組[18]報道了一種超長、超高效毛細管液相色譜柱的勻漿裝柱技術(shù)。高濃度的填料勻漿液和超聲震蕩是形成高均一填充床、獲得高效柱的途徑。作者利用 200 mg/ mL 的 2. 02 微米填料勻漿液填充了6 根長1 m、內(nèi)徑75 μm 的柱子，其中3 根在超聲條件下獲得了折合塔板高度為 1. 05 的結(jié)果。這表明高濃度勻漿填料加超聲可以制備超長、超高效毛細管液相色譜柱。
色譜-質(zhì)譜分析技術(shù)還用于研究人的生活習(xí)性、活動范圍，以及與人群之間的物質(zhì)交換等。Petras等[19]采用色譜-質(zhì)譜采集了大量日常生活中接觸的環(huán)境和物體上殘留的化合物樣品，以此分析數(shù)據(jù)用于關(guān)聯(lián)人的生活習(xí)慣和各種活動空間、接觸物體等。通過對居住的房間、開的車、光顧的飯店、工作的實驗室和辦公室等環(huán)境中接觸到的各種化學(xué)物質(zhì)和人體釋放的化學(xué)物質(zhì)的分析，可以從人群中描繪出一個人每天的各種習(xí)慣和留下的蹤跡，得到三維空間模型中各種接觸點（如門把手、自行車把手等）和皮膚接觸到的物體（如自行車架等）。大約 50% 的化合物來自其他人群和環(huán)境中的物質(zhì)。從中可以發(fā)現(xiàn)個人使用的化妝品、塑料用品、清洗劑、食物和食品添加劑，甚至吃的藥物等線索。這一研究在法醫(yī)學(xué)、醫(yī)療保健、建筑設(shè)計、空間探索與環(huán)境應(yīng)用中均有重要價值。
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