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博士研究生學(xué)位論文開(kāi)題報(bào)告
開(kāi)題報(bào)告是學(xué)位論文的一個(gè)總體規(guī)劃和設(shè)計(jì)，是研究生學(xué)位論文工作的重要環(huán)節(jié)，以下是小編搜集整理的博士研究生學(xué)位論文開(kāi)題報(bào)告，歡迎閱讀參考。論文題目：TGF-β1對(duì)白血病細(xì)胞的作用研究及其機(jī)制初探
一、立題依據(jù)
轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF- β)是一種多功能細(xì)胞因子，因其能使正常成纖維細(xì)胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)化而得名。它有五種異構(gòu)體：TGF-β1 TGF-β2、TGF-β3、 TGF-β4、 TGF-β5，其中TGF-β1作用最強(qiáng)，目前的研究也主要針對(duì)TGF-β1。TGF-β1是迄今為止了解的功能最復(fù)雜的細(xì)胞因子之一，是一種具有多種生物學(xué)功能的生長(zhǎng)因子,目前已知的功能主要有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,影響細(xì)胞粘連和細(xì)胞遷移，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成,調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過(guò)程,促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，參與對(duì)免疫抑制以及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等，TGF-β1還是促進(jìn)肝臟纖維化的重要細(xì)胞因子。TGF-β1 對(duì)不同的靶細(xì)胞也表現(xiàn)出不同的生物學(xué)活性，TGF -β受體廣泛表達(dá)于機(jī)體組織細(xì)胞,由于體內(nèi)大部分的正常細(xì)胞均表達(dá)TGF -β家族成員的膜結(jié)合受體, TGF-β1與其受體具有高度特異的親和力,因此, TGF-β1對(duì)許多細(xì)胞都發(fā)揮調(diào)節(jié)作用;生長(zhǎng)抑制是TGF-β1特有的性質(zhì), TGF-β1對(duì)大多數(shù)細(xì)胞的增值具有抑制作用,尤其是上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴樣細(xì)胞或造血細(xì)胞。
TGF-β1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),在腫瘤發(fā)生早期, TGF-β1 作為腫瘤抑制因子起作用, TGF-β1對(duì)正常細(xì)胞及早期腫瘤的抑制作用是通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期,抑制細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的，通過(guò)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)周期從G1 →S 期抑制正常細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞發(fā)生。在G1 期早期, TGF-β1誘導(dǎo)的抑制信號(hào)作用于原癌基因c-myc ,抑制腫瘤的形成; 在G1期晚期, TGF-β1通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白(cyclins) , 通過(guò)增加周期循環(huán)蛋白依賴性激酶(CDKs)的抑制性蛋白p15 、p21 、p27 的生成,抑制CDKs的活性,使細(xì)胞停止在G1 期或延長(zhǎng)G1 期,進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖, 誘導(dǎo)細(xì)胞分化或凋亡 。如果TGF-β1信號(hào)通路中多種基因突變導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)TGF-β1耐受而使衰老和凋亡通路失活,則可能發(fā)生細(xì)胞癌變。c-myc蛋白是細(xì)胞增殖的重要的調(diào)節(jié)因子,表達(dá)c-myc的細(xì)胞能迅速通過(guò)G1 期進(jìn)入S 期,而 TGF-β1可迅速下調(diào)c-myc 的mRNA 及蛋白水平。 近年來(lái),圍繞TGF-β1誘導(dǎo)凋亡的分子機(jī)制進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究。研究表明:在許多類型細(xì)胞中, TGF-β1家族成員不僅能抑制細(xì)胞增殖且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,由Smad 轉(zhuǎn)錄復(fù)合物控制的前凋亡基因在TGF-β1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起重要作用。 在造血細(xì)胞中, TGF-β1誘導(dǎo)的凋亡依賴于依賴Smad 的SHIP 表達(dá)的上調(diào)并通過(guò)生存蛋白激酶AKT抑制信號(hào)系統(tǒng)。
TGF-β1作為一種重要的腫瘤抑制因子,在血液系統(tǒng)疾病的發(fā)生中起重要作用，我們已在這方面開(kāi)展了若干研究中。我們前期研究中曾用ELISA法檢測(cè)急性白血病患者血清及急性白血病原代細(xì)胞和細(xì)胞株培養(yǎng)上清TGF-β1 水平變化，研究發(fā)現(xiàn)急性白血病患者血清中TGF-β1水平明顯減低，經(jīng)治療獲緩解后其水平恢復(fù)正常，復(fù)發(fā)患者TGF-β1水平又降低，急性白血病原代細(xì)胞和細(xì)胞株培養(yǎng)上清TGF-β1水平與正常細(xì)胞相比有明顯下降。應(yīng)用 RT-PCR 方法檢測(cè)正常巨核細(xì)胞、血小板、外周血有核細(xì)胞及8種細(xì)胞株包括有HEL、K562 、HL60 、U937 、DAMI、MEG-01 、HUT78、CA的TGF-β1 mRNA，結(jié)果顯示這些細(xì)胞均能表達(dá)TGF-β1，這說(shuō)明在白血病患者血清及急性白血病原代細(xì)胞和細(xì)胞株培養(yǎng)上清中TGF-β1的低水平很可能與TGF-β1自身產(chǎn)生過(guò)程下游蛋白的生成、包裝、分泌受破壞有關(guān)，這也提示TGF-β1的低表達(dá)可能在急性白血病發(fā)病機(jī)制中起重要作用。
TGF-β1對(duì)紅系、粒系、巨核系晚期祖細(xì)胞的分化均具有刺激作用，TGF-β1還有誘導(dǎo)粒系、淋巴系白血病細(xì)胞的凋亡作用，我們的研究發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化成熟的過(guò)程中，內(nèi)源性TGF-β1 mRNA表達(dá)上調(diào)，我們的研究也發(fā)現(xiàn)加入外源性豬全長(zhǎng)TGF-β1基因可抑制白血病細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡;另一實(shí)驗(yàn)中，將DAMI細(xì)胞與TGF-β1孵育48小時(shí)后不僅其生長(zhǎng)增殖受抑且有呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡;而在用 AS2O3誘導(dǎo) HL-60 細(xì)胞凋亡的過(guò)程中TGF-β1 表達(dá)水平增高，bcl-2 基因表達(dá)減弱，在此過(guò)程中，細(xì)胞分泌TGF-β1水平有明顯增高，加入TGF-β1反義ODNS 能夠部分抑制 AS2O3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，bcl-2 基因表達(dá)有所恢復(fù)，提示在AS2O3誘導(dǎo)的 HL-60細(xì)胞凋亡過(guò)程中內(nèi)源性 TGF-β1 起著重要作用，可能是促進(jìn)血細(xì)胞凋亡的內(nèi)在動(dòng)力之一。 同時(shí)我們還利用真核表達(dá)載體將外源性野生型p53基因(wt-p53)導(dǎo)入無(wú)p53蛋白表達(dá)的 HL-60、K562 細(xì)胞中，在 wt-p53 基因誘導(dǎo) HL-60、K562 細(xì)胞凋亡早期內(nèi)源性 TGF-β1mRNA 表達(dá)上調(diào)，且細(xì)胞分泌 TGF-β1 的水平有明顯提高，TGFβ1 的反義 ODNS 能夠部分抑制 wt-p53 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,使 wt-p53 所致的 K562 細(xì)胞 bcl-2 表達(dá)陽(yáng)性率恢復(fù)到未經(jīng) wt-p53 處理前的水平，提示 wt-p53 基因在誘導(dǎo)白血病凋亡過(guò)程中內(nèi)源性TGF-β1發(fā)揮一定作用，內(nèi)源性 TGF-β1與 bcl-2 表達(dá)之間存在密切關(guān)系。
由于TGF-β1有如此復(fù)雜的功能，對(duì)不同的靶細(xì)胞也表現(xiàn)出不同的生物學(xué)活性，我們?cè)O(shè)想通過(guò)外源誘導(dǎo)物準(zhǔn)確定量調(diào)控TGF-β1表達(dá)，若能調(diào)控成功必將能為我們下一步研究TGF-β1與腫瘤關(guān)系提供更多幫助。
迄今為止，己發(fā)展多種可誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，但各自都有局限性，多數(shù)可誘導(dǎo)基因表達(dá)以重金屬離子和激素作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)表達(dá)水平難以準(zhǔn)確調(diào)控，誘導(dǎo)刺激可引發(fā)多種效應(yīng)，且在誘導(dǎo)劑存在時(shí)，時(shí)常出現(xiàn)表達(dá)滲漏的現(xiàn)象，這些不足限制這些可誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用;而基于LiAC阻遏因子的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中，盡管其作用較為特異，但誘導(dǎo)過(guò)程緩慢，誘導(dǎo)效率低，且誘導(dǎo)劑量接近細(xì)胞毒水平，目前應(yīng)用最為廣泛的是四環(huán)素調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)(Tetracycline-regulated gene expressionsystem)，是由Gossen等人首先建立的。Tet 調(diào)控系統(tǒng)主要包括兩部分: 特異啟動(dòng)子控制下的Tc 依賴的反式作用子(tTA ) 及tTA 依賴的核心微小啟動(dòng)子(人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子PhCMV) 調(diào)控下的目的基因，前者是由大腸桿菌的tetR 和人類單純皰疹病毒(HSV ) 的病毒蛋白P16 (V P16) 的C2末端具有轉(zhuǎn)錄激活作用的區(qū)域構(gòu)成的融合蛋白, 其中TetR 介導(dǎo)tTA 與TetO 的結(jié)合,V P16 則具有轉(zhuǎn)錄激活作用; 后者是在PhCMV 的上游插入7 個(gè)頭尾相連的TetO 序列, PhCMV 本身啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力很低, 但tTA 與TetO 結(jié)合后即可激活目的基因高水平地表達(dá), 而Tc可抑制tTA 與TetO 的結(jié)合, 從而抑制轉(zhuǎn)錄，由于Tc的應(yīng)用阻抑了目的基因的表達(dá), 故將該系統(tǒng)稱為Tet-off 系統(tǒng)。
1995年，Gossen等基于Tet-off系統(tǒng)，通過(guò)隨機(jī)突變改變四環(huán)素阻遏蛋白(TetR )上4個(gè)氨基酸，使其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，建立了Tet-on基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)受四環(huán)素及其衍生物強(qiáng)力霉素作用剛好與Tet-of系統(tǒng)相反，即在沒(méi)有四環(huán)素及其衍生物強(qiáng)力霉素的情況下，表達(dá)水平幾乎為零，而在加入四環(huán)素及其衍生物強(qiáng)力霉素后目的基因高效表達(dá)。在Tet-off系統(tǒng)里，如果需關(guān)閉外源基因的表達(dá)，就需一直維持誘導(dǎo)物的存在，而Tet - on系統(tǒng)為激活型表達(dá)系統(tǒng)，需要外源基因表達(dá)時(shí)才加誘導(dǎo)物，相比之下，Tet一on系統(tǒng)具有快速激活基因，誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)受體內(nèi)Tet的影響相對(duì)較小，能更精確的進(jìn)行目的基因的調(diào)控，使用更為方便經(jīng)濟(jì)。所以，Tet - on系統(tǒng)已被成功的應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因鼠、基因治療研究
T-REx系統(tǒng)是一種用于哺乳動(dòng)物的四環(huán)素調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)，其調(diào)控元件來(lái)自大腸桿菌E. coli Tn10編碼的四環(huán)素耐藥操縱子。在該系統(tǒng)中，四環(huán)素對(duì)目標(biāo)基因的調(diào)控有賴于外源性四環(huán)素與質(zhì)粒中TetR結(jié)合，從而使控制目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子去阻遏，T-REx系統(tǒng)中最重要的構(gòu)成成分是可誘導(dǎo)表達(dá)質(zhì)粒---pcDNA4/TO/myc-h i s A, B, C。目的基因在該質(zhì)粒CMV啟動(dòng)子的調(diào)控下得以表達(dá)。該質(zhì)粒的CMV啟動(dòng)子中含有兩個(gè)四環(huán)素操縱子序列( Tet0 )，每個(gè)四環(huán)素操縱子含有19個(gè)核苷酸(5'-TCCCTATCAGTGATAGAGA-3')序列。兩個(gè)四環(huán)素操縱子序列被2個(gè)鹼基對(duì)的空間所隔開(kāi)。每個(gè)19個(gè)核苷酸序列做為一個(gè)TetR同源二聚體的結(jié)合位點(diǎn)。T-Rex中新近發(fā)展的Tet-off/Tet-on系統(tǒng)是一種高效無(wú)毒、具有嚴(yán)密開(kāi)/關(guān)功能的基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，具有嚴(yán)密性、特異性、高效性等優(yōu)點(diǎn)，該系統(tǒng)是目前比較成熟的真核生物基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)之一。
應(yīng)用T-REx調(diào)控系統(tǒng)對(duì)導(dǎo)入外源性TGF-β1基因進(jìn)行白血病細(xì)胞內(nèi)源性TGF-β1定量表達(dá)調(diào)控，以及定量調(diào)控后對(duì)白血病細(xì)胞生物學(xué)特性影響的研究目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道，本課題的研究旨在進(jìn)一步深入探討TGF-β1對(duì)白血病的作用及機(jī)制。
二、研究目的、意義和應(yīng)用前景
以白血病細(xì)胞HL-60為模型，人全長(zhǎng)TGF-β1基因?yàn)閷?duì)象，研究TGF-β1對(duì)白血病細(xì)胞體外和體內(nèi)作用的同時(shí)，利用四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng),構(gòu)建可調(diào)控的含人全長(zhǎng)TGF-β1基因真核表達(dá)載體，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將人TGF-β1基因轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞中，研究TGF-β1基因轉(zhuǎn)染后HL-60細(xì)胞的TGF-β1表達(dá)的定量調(diào)控，及轉(zhuǎn)染基因細(xì)胞的生物學(xué)特性改變，觀察轉(zhuǎn)染基因細(xì)胞的體內(nèi)致瘤性，進(jìn)一步探討TGF-β1對(duì)白血病的作用及機(jī)制。
三、課題設(shè)計(jì)方案及技術(shù)路線
(一)研究TGF-β1對(duì)HL-60細(xì)胞體內(nèi)外抗白血病的作用。
(二) pcDNA4- TGF-β1 質(zhì)粒構(gòu)建。
通過(guò)酶切→去磷酸化→連接→轉(zhuǎn)化→單克隆菌落培養(yǎng)擴(kuò)增→大量抽提，構(gòu)建并提取構(gòu)建好的pcDNA4- TGF-β1 質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定、酶切電泳鑒定、及最終DNA測(cè)序，選出全長(zhǎng)TGF-β1片段正向連入pcDNA4/TO的質(zhì)粒。
(三) pcDAN6/TR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞并篩選，單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。
1、確定Blasticidin 的篩選濃度。
2、脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞，通過(guò)Blasticidin篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞命名TREx- HL-60細(xì)胞。
(四)將構(gòu)建的pcDNA4- TGF-β1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 TREx- HL-60細(xì)胞,并篩選，單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。
1、確定Zeocin的篩選濃度。
2、脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染 TREx- HL-60細(xì)胞,通過(guò)Zeocin篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞命名HL-60-PTT細(xì)胞。
(五) 對(duì)HL-60-PTT細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性研究。
1、用ELISA法 、 Western blot方法測(cè)定不同濃度四環(huán)素作用下HL-60-PTT細(xì)胞的TGF-β1 的表達(dá)水平。
2、用定量PCR法測(cè)定不同濃度四環(huán)素作用下HL-60-PTT細(xì)胞的TGF-β1 mRNA.、TGF-β2 mRNA、TGF-β3 mRNA及TGF –βRⅠ、TGF –βRⅡ、hTERT、 Smad3、4、7、c-myc、bcl-2等基因表達(dá)的水平的變化。
3、觀察不同濃度四環(huán)素作用下HL-60-PTT細(xì)胞的增殖情況(分別采用MTT法測(cè)定、白血病細(xì)胞集落培養(yǎng)法及流式細(xì)胞儀檢測(cè)法)
4、對(duì)HL-60-PTT細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞調(diào)亡檢測(cè)(分別采用片段化DNA分析、TUNNEL及流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA含量方等法檢測(cè)。)
5、觀察ATRA誘導(dǎo)HL-60-PTT細(xì)胞分化過(guò)程中,不同濃度四環(huán)素作用下以下指標(biāo)的變化。
a、細(xì)胞分化的檢測(cè)：瑞氏染色觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分化抗原。
b、RT-PCR法檢測(cè)不同劑量下ATRA對(duì)HL-60-PTT細(xì)胞的影響：對(duì)TGF-β1 的定量表達(dá)與端粒酶活性及hTERT、c-myc和bcl-2等表達(dá)影響的研究。
(六) 通過(guò)攝入不同濃度四環(huán)素進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)染后HL-60-PTT細(xì)胞對(duì)裸鼠荷瘤的影響。
觀察腫瘤生長(zhǎng)大小、腫瘤細(xì)胞調(diào)亡情況及對(duì)小鼠心、肺、肝、脾、腎等臟器的影響。
四、預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
成功構(gòu)建pcDNA4- TGF-β1 質(zhì)粒，已篩選并擴(kuò)大培養(yǎng)TREx- HL-60細(xì)胞,目前正進(jìn)一步單克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞HL-60-PTT，通過(guò)ELISA法檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清TGF-β1，證實(shí)不同濃度四環(huán)素能誘導(dǎo)出不同水平的TGF-β1。(詳見(jiàn)幻燈)
五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
結(jié)果以數(shù)據(jù)及圖表表示，測(cè)定值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS11.0軟件分析，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間比較用最小顯著差法。
六、課題進(jìn)展安排
20XX.1-20XX.6 查閱文獻(xiàn)、確定課題
20XX.7-20XX.6 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備、預(yù)實(shí)驗(yàn)
20XX.7-20XX.3 正式實(shí)驗(yàn)
20XX.4-20XX.7 撰寫論文、答辯
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