不同消化時(shí)間對(duì)原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)影響
原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)重要的體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)，下面是小編搜集整理的一篇探究原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)影響的論文范文，供大家閱讀參考。
引言
原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)重要的體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)，其為建造心血管疾病發(fā)生發(fā)展過程的模型及探討基因、蛋白質(zhì)及信號(hào)通路的變化提供重要的基礎(chǔ)保障。此外，在體內(nèi)心肌細(xì)胞的活動(dòng)受到神經(jīng)、體液等多方因素的影響，限制對(duì)其病理變化的過程的研究。而體外培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞不僅具有心肌細(xì)胞固有的活性，而且還有不受神經(jīng)、體液等因素的影響的可控制性。因此，原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)的好壞，是影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。本研究通過比較不同消化時(shí)間對(duì)原代心肌細(xì)胞的影響，探討一套簡(jiǎn)便易行、成活率高的原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法。
1材料與方法
1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇出生1~2d的Wistar大鼠，清潔級(jí)，雌雄不限，由內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物研究中心提供，合格證編號(hào)：csxk(蒙)2002-0001.楊木小刨花墊窩，濕度45%~50%,溫度控制在21~27℃。
1.2主要試劑及儀器DMEM高糖培養(yǎng)基(含100U青霉素+鏈霉素雙抗)、胎牛血清、Ⅱ型膠原酶(Worthington公司，美國(guó))、磷酸鹽緩沖液(PBS)、臺(tái)盼藍(lán)染色液;5-溴-2-脫氧尿苷(Brdu)、4%多聚甲醛、過氧化酶阻斷溶液、羊血清、α-actin抗體(兔抗大鼠)、二氨基聯(lián)苯胺(3,3'-diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒、SABC(鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法)免疫組化試劑盒、Mayor's蘇木精、二甲苯、TritonX.100(生工生物工程有限公司，中國(guó))、37℃恒溫浴鍋、醫(yī)用超凈工作臺(tái)、二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、恒溫離心機(jī)等。
1.3實(shí)驗(yàn)步驟①將大鼠浸沒在75%乙醇中消毒2次，左手固定乳鼠暴露胸部，右手持眼科剪沿其胸骨左側(cè)剪開，壓住肺葉，心臟收縮時(shí)可見其膨出。
眼科鑷鈍性分離下心臟，放入有10mL10%DMEM培養(yǎng)基(含雙抗)的培養(yǎng)皿中。②在第1個(gè)培養(yǎng)皿中擠出心臟的積血并鈍性分離出1/2~2/3心室下半部分，依次在第2、3個(gè)平皿中洗滌后放入小燒杯中，用眼科剪快速將所有心臟剪成約1mm3小塊。③取5mL消化液放入小燒杯，并輕晃燒杯5~8次，棄去消化液。再次放入3mL消化液，用直頭吸管將燒杯中的混合物轉(zhuǎn)移到有膠塞的玻璃管中，并將其置于37℃水浴鍋中并不斷晃動(dòng)8~10min,隨后棄去消化液。④取新消化液5mL加入到玻璃管中，37℃水浴并晃動(dòng)8~10min.將組織消化液移入50mL離心管，在此之前管中先放入20mL已溫育的含20%FBS的DMEM(H+),并混勻終止消化。重復(fù)此步驟6~7次，直到組織快消化為白色絮狀物為止。
⑤將收集的消化液800r/min的轉(zhuǎn)速離心5min,棄上清。向離心沉淀中加入含10%FBS的DMEM(H+)10mL混勻，用300目濾網(wǎng)過濾。將濾液放入培養(yǎng)瓶中，于37℃孵箱中孵育90min,差速貼壁90min后取出培養(yǎng)瓶，輕輕晃動(dòng)，將上層懸濁液混勻移入孔板中(8min和10min接種濃度相同),以每1mL培養(yǎng)基中加入10μLBrdu,繼續(xù)溫箱培養(yǎng)，24h后更換10%FBSDMEM(H+).⑥取出細(xì)胞爬片用PBS緩沖液洗滌2次，吸去PBS后加入適量4%多聚甲醛固定30min,蒸餾水洗滌2min×2次，吸干，加入適量蘇木精染色液室溫下染色8min,流動(dòng)水沖洗約10min后吸干，蒸餾水洗滌1次后浸入95%乙醇5s,吸干后加入適量伊紅染色液室溫下染色30min,70%乙醇洗滌2次，吸干后置室溫下晾干。
1.4原代心肌細(xì)胞活力測(cè)定①臺(tái)盼藍(lán)染色法：取細(xì)胞懸濁液100μL,加入100μL臺(tái)盼藍(lán)溶液(2×),混勻。其鏡下表現(xiàn)為死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，而活細(xì)胞拒染。取10μL用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)4個(gè)大格中的活細(xì)胞總數(shù)和染成藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)。使用血球計(jì)數(shù)板在倒置顯微鏡下分別計(jì)數(shù)分離純化前和分離純化后的細(xì)胞成活率，分別計(jì)數(shù)3次，取其平均值。計(jì)算公式：細(xì)胞存活率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%②比較8min和10min消化時(shí)間下原代心肌細(xì)胞的活力：在倒置顯微鏡下觀察胞搏動(dòng)頻率，每次觀察10個(gè)細(xì)胞取平均值，對(duì)2種消化時(shí)間下原代心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率進(jìn)行比較。
1.5原代心肌細(xì)胞的鑒定制作細(xì)胞爬片，培養(yǎng)48h后取出，采用橫紋肌肌動(dòng)蛋白(α-actin)作免疫染色，進(jìn)行心肌細(xì)胞的鑒定。α-actin為一抗，同時(shí)用PBS作為一抗進(jìn)行對(duì)照。取爬片，4%多聚甲醛室溫固定、0.1%Triton100室溫孵育穿透及滅活內(nèi)源性過氧化物酶各30min后，滴加1∶100的α-actin抗體(兔IgG),4℃過夜，孵育二抗20min,最后DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染。封固后，顯微鏡下拍照。
1.6建立心肌肥大模型原代心肌細(xì)胞孔板中加入血管緊張素II(AngiotensinII,Angll),使其終濃度為10-5mmoI/L,形成心肌肥大模型(即實(shí)驗(yàn)組);對(duì)照組加入相同體積的10%FBSDMEM(H+)培養(yǎng)液，作用48h后，采用RT-PCR技術(shù)觀察原代心肌細(xì)胞肥大標(biāo)志性基因心房鈉尿肽(atrialnatriureticpeptide,ANP)mRNA表達(dá)變化[1].培養(yǎng)的原代心肌細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化懸浮后，在相同相差顯微鏡下拍攝照片，用圖像處理系統(tǒng)測(cè)量細(xì)胞的截面面積。
1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2結(jié)果
2.1細(xì)胞形態(tài)
2.1.1倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)培養(yǎng)12h后，細(xì)胞部分貼壁，多呈圓形、梭形及三角形。培養(yǎng)24h后，細(xì)胞基本上全部貼壁，并呈有自發(fā)搏動(dòng)，8min及10min消化時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)未見明顯異常。培養(yǎng)48h后，8min消化時(shí)間的細(xì)胞少量伸出偽足，多呈三角形及多邊形，而10min消化時(shí)間的細(xì)胞大部分伸出偽足相互接觸交織成網(wǎng)，逐漸形成細(xì)胞簇，立體感明顯，細(xì)胞搏動(dòng)及收縮均較明顯而有力。
2.1.2HE染色后光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞核染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)染成淡紅色，核膜較為清晰。
原代心肌細(xì)胞數(shù)量較多呈簇狀聚集，細(xì)胞呈多角形、伸出多量偽足，細(xì)胞核豐滿、大小均勻，細(xì)胞質(zhì)豐富且著色均勻，見圖1a、b.心肌成纖維細(xì)胞細(xì)胞核染成藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)染成淡紅色，細(xì)胞核膜較為清晰，平坦，細(xì)胞體較大，細(xì)胞質(zhì)透明而薄，細(xì)胞核較大，呈橢圓形，顏色淡，見圖1c.
2.2心肌細(xì)胞活力檢測(cè)結(jié)果
2.2.1臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果分離純化前活細(xì)胞的平均存活率>90%,消化8min組和10min組比較未見明顯區(qū)別(P>0.05).分離純化后活細(xì)胞的平均存活率也>90%,且10min組的平均存活率高于8min組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1.2.2.2原代心肌細(xì)胞搏動(dòng)原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)48h后，2種消化時(shí)間的細(xì)胞搏動(dòng)均達(dá)40~50次/min;細(xì)胞培養(yǎng)5d后，發(fā)現(xiàn)8min消化時(shí)間的細(xì)胞搏動(dòng)的數(shù)量及次數(shù)均明顯減少，而10min的細(xì)胞搏動(dòng)未見明顯變化。
2.3免疫組化結(jié)果原代心肌細(xì)胞呈陽(yáng)性反應(yīng)，細(xì)胞質(zhì)呈深棕色，8min和10min消化時(shí)間的細(xì)胞陽(yáng)性率均>95%,而心肌成纖維細(xì)胞呈陰性反應(yīng)，細(xì)胞質(zhì)無(wú)棕色顆粒，見圖2.
2.4細(xì)胞截面平均面積10min消化時(shí)間的原代
心肌細(xì)胞ANP的CT值比較，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組表達(dá)顯著升高(P<0.05),而內(nèi)參GADPH的CT值比較，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).Angll作用原代心肌細(xì)胞48h后，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞截面平均面積比較明顯增加(P<0.05),而8min的原代心肌細(xì)胞截面面積和ANP值未見顯著變化(P>0.05).3討論原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)為建立心肌模型提供有效的技術(shù)手段，并逐漸趨于成熟。自1960年Harary等[2]首次成功的培養(yǎng)出Wister乳鼠的原代心肌細(xì)胞起，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法不斷地進(jìn)行研究及改進(jìn)，并取得一定成果�，F(xiàn)有資料顯示，影響原代心肌細(xì)胞成活率及活性的主要因素有消化溫度、消化酶及消化時(shí)間。目前，消化酶的選擇主要有2種，即單獨(dú)使用胰酶[3-4]和胰酶+膠原酶合用[5-6].胰酶能分解組織間質(zhì)的蛋白成分，膠原酶的作用是特異性地水解細(xì)胞間質(zhì)中的膠原纖維，因胰酶作用較強(qiáng)易破壞細(xì)胞膜，而膠原酶作用緩和，近年來(lái)主要采用胰酶和膠原酶合用來(lái)進(jìn)行消化。在選用胰酶+膠原酶的實(shí)驗(yàn)中多數(shù)采用其最適溫度37℃進(jìn)行消化，或單獨(dú)應(yīng)用胰酶4℃過夜[7],采用其較弱的活性充分分解心肌組織間質(zhì)，之后在應(yīng)用膠原酶進(jìn)行消化，以減少對(duì)細(xì)胞膜的損傷，提高細(xì)胞的成活率和活性。
原代細(xì)胞培養(yǎng)計(jì)數(shù)的步驟已趨于成熟，本研究在結(jié)合自身實(shí)驗(yàn)室條件及環(huán)境下進(jìn)行反復(fù)摸索，得到了一套簡(jiǎn)便易行并且能或得較高成活率、純度及活性的原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法。同時(shí)，在其他操作條件不變的情況下，探討不同消化時(shí)間如8min及10min對(duì)原代心肌細(xì)胞的成活率、活性的影響。
在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用了目前有關(guān)原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中相對(duì)成熟的步驟，如選擇出生3d內(nèi)的乳鼠[8]及采用90min差速貼壁法和Brdu抑制法分離純化細(xì)胞[9-10]等。在消化酶方面，只采用作用較緩和的膠原酶在37℃進(jìn)行消化，同時(shí)，采用短時(shí)間多次消化的.方式，防止膠原酶消化不徹底，從而增加細(xì)胞的產(chǎn)量。在消化時(shí)間方面，本研究采用8min和10min消化時(shí)間，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，2組純度鑒定陽(yáng)性率均達(dá)到95%以上，而8min組的細(xì)胞形態(tài)明顯滯后于10min組，且10min組的存活時(shí)間和存活率顯著高于8min組。本研究認(rèn)為采用8min消化法獲得的細(xì)胞生存時(shí)間短可能的原因是由于膠原酶消化不徹底，細(xì)胞在震蕩中從組織中分離下來(lái)，也可能損傷細(xì)胞膜，所以導(dǎo)致成活率較10min低。另一方面，由于細(xì)胞數(shù)量少，接種到孔板中的細(xì)胞濃度低而影響到單個(gè)細(xì)胞的搏動(dòng)及同步化搏動(dòng)。最后，利用消化時(shí)間為10min心肌細(xì)胞成功的建立心肌肥大模型，AngII作用48h后心肌細(xì)胞即實(shí)驗(yàn)組ANP和表面積與對(duì)照組相比表達(dá)顯著升高和增加，而消化時(shí)間為8min的心肌細(xì)胞表面積和ANP值未見顯著變化。與其他原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)相比，本研究成功的從活性和實(shí)用性方面說(shuō)明消化時(shí)間是其重要的影響因素。同時(shí)說(shuō)明，該心肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法能夠應(yīng)用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的研究。
應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)方法獲取心肌細(xì)胞要注意以下幾個(gè)方面：①選擇有正常生育周期及哺乳周期的育齡期母鼠進(jìn)行生育。因母鼠的狀態(tài)會(huì)直接影響幼鼠的成活率和生長(zhǎng)狀態(tài)及心臟發(fā)育的狀態(tài);②心肌細(xì)胞培養(yǎng)的過程中要遵守?zé)o菌操作的規(guī)則，用到的器械及玻璃制品要進(jìn)行高壓滅菌。乳鼠也需要在75%乙醇中消毒2次，取心臟時(shí)應(yīng)快速，以使取出的心臟仍有搏動(dòng)。此外，還要避免剪破腹腔，防止污染;③丟棄第1次消化心肌組織的膠原酶，以去除組織中的血細(xì)胞及表面的纖維細(xì)胞;④37℃消化時(shí)應(yīng)不斷搖晃使消化液與組織充分混勻;⑤經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證，在心肌細(xì)胞培養(yǎng)的最初24h內(nèi)越少移動(dòng)細(xì)胞，其生長(zhǎng)狀態(tài)越好。
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