經(jīng)濟高效的人足月胎盤滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)方法
胎盤是維持胎兒在宮內(nèi)營養(yǎng)、發(fā)育的重要器官，下面是小編搜集整理的一篇探究胎盤滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)方法的論文范文，供大家閱讀參考。
前言
胎盤是妊娠期存在的特殊器官，是母體與胎兒之間物質(zhì)交換的場所，是維持胎兒在宮內(nèi)營養(yǎng)、發(fā)育的重要器官[1].胎盤細胞成分復雜，其中滋養(yǎng)細胞在胚胎植入、妊娠維持中扮演著重要角色，其功能調(diào)節(jié)失常與多種妊娠相關疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。目前滋養(yǎng)細胞的體外模型主要有原代滋養(yǎng)細胞和滋養(yǎng)細胞系兩大類，滋養(yǎng)細胞系操作方便，但是任何一種滋養(yǎng)細胞系都無法完全替代原代滋養(yǎng)細胞。
課題組前期[2-4]已經(jīng)成功培養(yǎng)出早孕期絨毛滋養(yǎng)細胞，同時對趨化因子在早孕期母胎界面的免疫調(diào)節(jié)機制做了一系列的研究。但是早孕期絨毛中提取的細胞數(shù)量十分有限，若進行分組實驗則會受到細胞數(shù)量的限制。近年來有研究[5]認為足月胎盤中富含滋養(yǎng)細胞，并且這個時期的細胞對研究滋養(yǎng)細胞相關的病理妊娠有很大的價值。本研究在前期研究的基礎上，擬建立一種經(jīng)濟、高效的人足月胎盤滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)方法，為日后研究滋養(yǎng)細胞及相關疾病提供重要的實驗基礎。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1胎盤組織選取武漢大學中南醫(yī)院婦產(chǎn)科因社會因素行剖宮產(chǎn)的健康產(chǎn)婦。產(chǎn)婦年齡為20-35歲，孕周為37-40周，均為單胎妊娠，排除高血壓、心臟病及傳染病史。術中用無菌手術剪剪取臍帶周邊面積為5cm×5cm大小的胎盤組織，立即放入含雙抗(青霉素0.1g/L,鏈霉素0.1g/L)無菌PBS中于2h內(nèi)送回實驗室，4℃保存。標本收集經(jīng)武漢大學中南醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準及孕婦本人知情同意。
1.1.2主要試劑及儀器DMEM/F-12(美國Hy-clone)，胰蛋白酶粉、青霉素-鏈霉素雙抗溶液、DNA酶Ⅰ型DN25、細胞外基質(zhì)膠(extracellularmatrix,ECM膠)、CCK-8試劑盒(美國Sigma公司);胎牛血清(美國GIBCO公司)，Percoll細胞分離液(美國phamacia公司)，小鼠抗人角蛋白(cytokeratin,CK)-7單克隆抗體、兔抗人波形蛋白(Vimentin)多克隆抗體、免疫組化試劑盒、免疫組化DAB試劑盒(福州邁新生物技術開發(fā)公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(美國SHELLAB)，倒置顯微鏡(日本Olympus);恒溫搖床、離心機(德國Eppendorf)、酶標儀、無菌超凈臺。
1.2方法
1.2.1原代培養(yǎng)取約40g胎盤組織，在無菌操作臺中用無菌手術剪將胎盤組織分離除去大血管、結締組織，用無菌PBS反復沖洗血污，直至沖洗液接近無色。將組織盡量剪碎至1-3mm3,并盡可能去除肉眼可見的小血管和纖維連接成分。將剪碎的組織加入終濃度為0.25%胰酶和0.2mg/mlDNAseⅠ組成消化液，分3次消化，消化液總體積分別為150,100,75ml.分別在恒溫搖床中37℃、120r/min消化20min.前兩次的消化液經(jīng)100目網(wǎng)篩過濾后倒除，剩余組織再進行第3次消化，血清終止消化、網(wǎng)篩過濾后收集消化液，4℃離心1500r/min,15min,離心后棄上清以3mlDMEM/F-12重懸細胞。
1.2.2細胞純化---不連續(xù)Percoll密度梯度分離在15ml無菌離心管中按濃度從大到小逐層鋪入70%,50%,30%,10%4個密度的Percoll分離液[6],每個密度鋪3ml.然后將3ml細胞懸液緩慢加于Percoll分離液上層，4℃水平離心機下2000r/min離心20min.用吸管小心吸取30%-50%之間云霧狀的細胞層(滋養(yǎng)細胞)，放入一支無菌離心管里，用約4mlDMEM重懸細胞，室溫下1000r/min離心5min.棄上清后的細胞沉淀，用含15%胎牛血清的DMEM/F-12重懸細胞，將細胞懸液濃度調(diào)整至1×106ml,種于預先置有蓋玻片以及鋪好ECM膠的6孔板內(nèi)，5%CO2、37℃的溫箱里培養(yǎng)。
1.2.3細胞鑒定細胞培養(yǎng)24h后取出6孔板中細胞爬片，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定15min.固定細胞經(jīng)0.1%TritonX-100增加細胞膜通透性后，按照免疫組化試劑盒進行操作。封閉液室溫孵育15min后，PBS洗3遍，分別加入CK-7、Vimen-tin單克隆抗體，PBS代替一抗作為陰性對照，4℃孵育過夜。次日依次加入生物素標記二抗、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶反應試劑，DAB避光顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察拍照計算純度。
1.2.4CCK-8增殖實驗分離得到的原代滋養(yǎng)細胞以2×105細胞/孔種植于96孔板，培養(yǎng)24,48,72,96,120h,每孔加入CCK-8液10μl,37℃繼續(xù)孵育2h后，終止培養(yǎng)，選擇450nm波長，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的吸光度值。
2結果
2.1免疫細胞化學鑒定足月胎盤滋養(yǎng)細胞
細胞爬片染色結果顯示，CK-7標記細胞胞質(zhì)和胞膜可見明顯的棕黃色染色，陽性表達的`細胞大于90%(圖1A);波形蛋白染色與陰性對照組均表達陰性(圖1B、1C).
2.2體外培養(yǎng)足月胎盤滋養(yǎng)細胞生長的動態(tài)觀察
每次取材組織量約30-40g,可獲得細胞數(shù)量大于107個細胞。新鮮分離的細胞為均一的圓形單核細胞，核大突出，胞質(zhì)豐富(圖2A)。培養(yǎng)3h后開始貼壁(圖2B),12h后基本全部貼壁，細胞呈胖三角形或不規(guī)則多角形和圓形，24h后可見細胞開始融合成具有多個核的合體滋養(yǎng)細胞，并隨著時間推移逐漸融合成片生長(圖2C)。細胞不能傳代生長。
2.3滋養(yǎng)細胞體外增殖活力
利用CCK-8增殖實驗檢測原代培養(yǎng)滋養(yǎng)細胞體外增殖能力，從生長曲線上看細胞在體外96h可達小高峰，但不能成倍增殖，表明細胞體外增殖能力低下(圖3).【1】
3討論
滋養(yǎng)細胞是構成胎盤的主要細胞，在維持妊娠和抵御病原微生物的宮內(nèi)傳播中扮演著重要角色[7].流產(chǎn)、早產(chǎn)、妊娠期高血壓疾病、胎兒生長受限等多種產(chǎn)科疾病都可能與滋養(yǎng)細胞的功能異常相關[8-10],因此建立滋養(yǎng)細胞體外培養(yǎng)模型是滋養(yǎng)細胞相關的病理妊娠機制研究的實驗基礎，具有十分重要的意義。晚孕期胎盤絨毛組織中細胞成分復雜，滋養(yǎng)細胞的純化是此研究的關鍵。胎盤滋養(yǎng)細胞的分離方案中，以1986年Kliman等[11]建立的Per-coll連續(xù)密度梯度分離法最為經(jīng)典。其方法為配制14個不同密度的Percoll細胞分離液，利用不同細胞的相對懸浮密度不同的原理，將胎盤絨毛中不同成分的細胞分開，可獲得滋養(yǎng)細胞純度可達85%,并確定滋養(yǎng)層細胞在percoll中所處的密度值為1.048-1.062g/L.但該方法操作繁瑣耗時，稍有不慎極易導致實驗失敗。后續(xù)有研究[12,13]將該方法簡化為35%、45%或者30%、60%兩個分離梯度，王冬菊等研究[14]表明只用兩個梯度根本不能將細胞很好的區(qū)分開，其將percoll密度梯度簡化為10%、30%、50%、70%,細胞懸液經(jīng)密度梯度離心后，在4個梯度之間均能形成明顯的分離帶，從上至下分別為細胞碎片層、滋養(yǎng)細胞層、胎盤間充質(zhì)干細胞和淋巴細胞層、紅細胞。并用單標法結合流式細胞術檢測細胞純度可達85%以上。之前的研究均強調(diào)收集三次消化所得的細胞懸液，但本研究建議舍棄第1次和第2次的消化液，只保留第3次的消化液。前期研究將3次消化的消化液分別經(jīng)過percoll密度梯度離心后發(fā)現(xiàn)，前兩次主要是細胞碎片層和紅細胞層，第3次消化液經(jīng)密度梯度純化后可見明顯的滋養(yǎng)細胞層，更關鍵是經(jīng)過前兩次消化紅細胞和雜細胞數(shù)量大大減少，更有利于細胞計數(shù)和種板，此操作節(jié)約percoll用量，節(jié)約成本，更有利于純化細胞。
此外，滋養(yǎng)細胞體外生長增殖能力低下，種植于普通培養(yǎng)板時，不易貼壁生長。
ECM膠主要是由蛋白聚糖、層黏連蛋白等構成，對細胞黏附、生長和增殖等起到促進作用，通過前期摸索，我們發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)板鋪以一定厚度的ECM膠，有利于滋養(yǎng)細胞貼壁生長。
原代培養(yǎng)過程中需注意以下環(huán)節(jié)：
�、偃〔幕颊叩哪挲g越小，組織越新鮮越好，培養(yǎng)時容易得到活力更好數(shù)量更多的滋養(yǎng)細胞。
�、跇吮緫糜跓o菌等滲液中保持其活性，用冰盒送回實驗室并在2h內(nèi)進行處理，時間過長組織容易失去活性，取回的標本應用含雙抗的PBS徹底反復清洗至液體清亮，因紅細胞在培養(yǎng)過程中也會消耗培養(yǎng)液中養(yǎng)分，容易造成細胞生長受限。
�、劢M織盡量剪成漿糊狀，越碎消化越充分，消化液的體積和消化次數(shù)可以根據(jù)組織量調(diào)整，至少消化3次。
④ECM膠盡量鋪薄且均勻，細胞種板前鋪好膠，并置于溫箱中使其充分干燥。
本研究在前期基礎上進一步簡化了實驗操作步驟，一次性可獲得大量且純度較好的胎盤滋養(yǎng)細胞，可同時滿足多種實驗方法對細胞數(shù)量的需求，為日后進行滋養(yǎng)細胞相關疾病的研究提供重要的實驗基礎。
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