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細胞凋亡學(xué)說在帕金森病發(fā)病機制的理論探索
【關(guān)鍵詞】 帕金森病;發(fā)病機制;細胞凋亡
帕金森病(PD)主要癥狀包括靜止性震顫、肌肉僵直、運動遲緩和姿勢平衡障礙等，病理變化主要為黑質(zhì)致密部(DSN)和多巴胺(DA)能神經(jīng)元選擇性變性〔1〕。PD病情呈漸進性的加重過程，患者晚期生活無法自理，最終死于肺部感染等并發(fā)癥。PD 在中老年人群發(fā)病率很高，流行病學(xué)調(diào)查顯示〔2〕，55 歲以上人口 PD 患病率為 1.4%，在 75 歲以上人口達 3.4%。PD 被發(fā)現(xiàn)以來其病因到目前仍不明確，有關(guān)病因的假說主要有遺傳學(xué)說和環(huán)境毒素學(xué)說。隨著研究水平的提高，從細胞凋亡理論探索PD的發(fā)病機制近幾年受到了國內(nèi)外學(xué)術(shù)界的關(guān)注。
1 PD研究中已克隆出的相關(guān)基因與細胞凋亡〔3〕
見表1。這些基因的發(fā)現(xiàn)能夠解釋家族性 PD 的病因，但家族性PD占PD病人的總數(shù)還不到10%，其余的大部分都是散發(fā)性PD，很難確定其中的遺傳因素。環(huán)境毒素學(xué)說的提出最早開始于1?甲基?4?苯基?1，2，3，6?四氫吡啶(1?methyl?4? phenyl?1，2,3,6?tetrahydropyridine，MPTP)毒性作用的發(fā)現(xiàn)〔4〕。人類和非靈長類動物給予MPTP后引起PD的運動缺乏表現(xiàn)，并且伴隨著有DSN、DA 能神經(jīng)元的選擇性破壞和DA含量的顯著降低。另外，除草劑和殺蟲劑的使用與PD的發(fā)生呈正相關(guān)。魚藤酮是一種被廣泛應(yīng)用的殺蟲劑，能夠抑制線粒體復(fù)合體Ⅰ的活性。在動物實驗中發(fā)現(xiàn)，靜脈注射魚藤酮可以選擇性造成DA能神經(jīng)元的死亡，殘存神經(jīng)元內(nèi)形成一種被稱為Lewy小體的物質(zhì)，并且動物出現(xiàn)類似PD運動障礙的癥狀〔5〕。這都表明在散發(fā)型PD的發(fā)病過程中環(huán)境因素可能起著重要的作用。雖然遺傳學(xué)說和環(huán)境毒素學(xué)說都各有依據(jù)，但彼此不能互相否定。許多遺傳學(xué)的研究不能排除親緣關(guān)系較近的人群受共同生活環(huán)境的影響;而環(huán)境毒素學(xué)說也不能解釋為什么接觸毒素后僅有少數(shù)人出現(xiàn)了PD癥狀。這就產(chǎn)生了另外一個假說，即大部分PD是在一定的遺傳背景下受環(huán)境毒素侵害而發(fā)病的，但這一學(xué)說有待于相關(guān)研究的證實。
PD的發(fā)病機制尚未明確。目前有關(guān)PD發(fā)病機制的假說有氧化應(yīng)激、線粒體損傷、神經(jīng)興奮毒性、神經(jīng)營養(yǎng)缺失、蛋白水解應(yīng)激、免疫異常、炎癥反應(yīng)、多巴胺轉(zhuǎn)運體失活、α?synuclein異常沉積和細胞凋亡等，其中神經(jīng)興奮毒性、氧化應(yīng)激和細胞凋亡學(xué)說較受重視〔6〕。神經(jīng)興奮毒性學(xué)說認為興奮型神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸(Glu)等大量釋放，通過激動α?氨基羥甲惡唑丙酸(AMPA)受體及N?甲基D天門冬酸(NMPA)受體和代謝型Glu受體以及通過膜去極化激活電壓依賴性鈣通道造成胞內(nèi)鈣超載，最終通過一系列機制導(dǎo)致細胞死亡。氧化應(yīng)激學(xué)說認為PD是由于神經(jīng)細胞氧化磷酸化過程中所產(chǎn)生的自由基過多或自由基清除功能減弱導(dǎo)致過多的氧自由基攻擊某些關(guān)鍵酶、生物膜類脂和DNA，最終導(dǎo)致細胞死亡。PD的發(fā)病因素如氧化應(yīng)激、抗氧化功能缺失和線粒體功能損傷等均可在不同水平誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡〔1〕。
表1 已克隆的PD相關(guān)基因
基因名稱遺傳方式基因位點染色體位點α?synuclein顯性遺傳PARK1(28)4q21?q23Parkin隱性遺傳PARK2(58)6q25.2?27未命名顯性遺傳PARK3(74)2p13α?synuclein顯性遺傳PARK4(30，31)4qUchL1顯性遺傳PARK5(59)4p14未命名隱性遺傳PARK6(75)1p35?p36DJ?1隱性遺傳PARK7(76)1p36未命名顯性遺傳PARK8(77)12p11q13.1未命名隱性遺傳PARK9(78)1p36未命名遲發(fā)易患基因PARK10(79)1p32NR4A2易患基因NA(80)2q22?23Synphilin?1易患基因NA(81)5q23.1?23.3Tau易患基因NA(40)17q21
細胞凋亡又稱程序性細胞死亡(PCD)，它是上世紀70年代提出的一種不同于壞死的細胞死亡方式，是有核細胞在一定條件下通過啟動自身內(nèi)部機制，即主要通過內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細胞自然死亡過程，維持組織細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、將一些多余細胞清除的必不可少機制〔7〕。然而，PCD也是一種病理現(xiàn)象，如在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)現(xiàn)有大量的神經(jīng)元發(fā)生凋亡〔1,2〕。PCD是受基因調(diào)控的主動的細胞自殺現(xiàn)象，調(diào)控PCD的基因有：p53基因、Bcl?2基因家族、c?myc基因和survivin基因等。關(guān)于PCD過程中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，目前認為主要通路有兩條：膜受體通路和線粒體通路。這兩條通路的下游途徑都是通過激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細胞死亡〔8〕。
2 PD 神經(jīng)元凋亡的主要誘發(fā)因素〔9〕
目前大量的研究表明氧化應(yīng)激可能在 PD 的發(fā)生、神經(jīng)細胞最終凋亡中發(fā)揮重要作用。自由基的生成主要有以下幾個方面：①過氧化氫(H2O2)是DA代謝過程中產(chǎn)生的正常代謝副產(chǎn)物。酪氨權(quán)羥化酶(TH)催化生成 DA 和單胺氧化酶(MAO?B)降解DA時都有H2O2的生成，DA自身氧化也可產(chǎn)生少量的H2O2，H2O2分解產(chǎn)生·OH。這個過程在鐵存在時加速，尤其是Fe2+，用反應(yīng)式表示為：Fe2++H2O2→Fe3++OH?+·OH，即Fenton反應(yīng)。在PD患者腦中發(fā)現(xiàn)了鐵水平的異常升高，而結(jié)合Fe2+的鐵蛋白的水平則下降。②外源性神經(jīng)毒素如 MPTP，經(jīng)膠質(zhì)細胞內(nèi) MAO?B 酶氧化還原形成 MPP+，MPP+經(jīng)DA轉(zhuǎn)運體攝取至DA神經(jīng)元內(nèi)，MPP+抑制線粒體復(fù)合體Ⅰ導(dǎo)致呼吸鏈產(chǎn)生大量的自由基，從而造成對細胞內(nèi)生物大分子的損傷，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。③自由基的另一個來源為大腦黑質(zhì)病變時，一氧化氮合成酶 (NOS) 的表達增加導(dǎo)致一氧化氮(NO)和過氧硝酸鹽自由基水平升高。另外，小膠質(zhì)細胞的激活可增加活性氧簇(ROS)的釋放。正常情況下體內(nèi)有完整的自由基清除體系，包括Vitmain A,C,E,微量元素Se,Zn,Mn和內(nèi)源性物質(zhì)包括谷胱甘肽(GSH)、過氧化物歧化酶(SOD)、輔酶Q、NADPH、褪黑素以及尿素等。但在PD患者黑質(zhì)中發(fā)現(xiàn)GSH和總谷胱甘肽(GSH+GSSG)水平降低。Nakamura等〔10〕發(fā)現(xiàn)GSH的降低使DA能神經(jīng)元對MPP+的神經(jīng)毒效應(yīng)增敏。使用自由基清除劑可使包括MPP+在內(nèi)的復(fù)合體Ⅰ抑制劑誘導(dǎo)的PCD減少，說明了復(fù)合體Ⅰ抑制后產(chǎn)生凋亡的過程包含自由基的生成。在PD患者尸檢研究發(fā)現(xiàn)〔11〕，患者黑質(zhì)中脂質(zhì)過氧化物水平明顯升高。因此，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的各種因素的協(xié)同作用，包括線粒體功能障礙、DA能代謝產(chǎn)物的增加、鐵含量增加以及GSH的耗竭等，可誘發(fā)DA能神經(jīng)元的變性和壞死。
3 PD 神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵事件
線粒體是細胞的一個獨特而重要的細胞器，細胞內(nèi)氧化磷酸化、能量代謝和抗氧化作用都有賴于線粒體功能的發(fā)揮。線粒體亦是PCD調(diào)控中心。在凋亡早期，細胞形態(tài)改變之前，最早表現(xiàn)為線粒體跨膜電位下降�？缒る娢皇蔷�粒體維持正常功能的必備條件�？缒る娢幌陆岛�，線粒體膜的滲透性發(fā)生改變，引起線粒體腫脹，線粒體膜上的孔或通道增大，使線粒體內(nèi)的物質(zhì)外流。細胞色素C從線粒體釋放是PCD的關(guān)鍵步驟。釋放到胞漿的細胞色素C在dATP存在的條件下能與Apaf?1結(jié)合，使其形成多聚體，并促使caspase?9酶原與其結(jié)合形成凋亡體，caspase?9酶原被自我活化，活化的caspase?9能激活其他的caspase如caspase?3等，caspase?3水解其底物，從而誘導(dǎo)PCD。在PD患者中可檢測到線粒體功能障礙，主要是線粒體復(fù)合體Ⅰ受損。復(fù)合體Ⅰ位于線粒體內(nèi)膜，為生成ATP的氧化磷酸化系統(tǒng)的一部分。線粒體功能障礙的原因至今不明，有人認為是編碼氧化磷酸化系統(tǒng)某些蛋白的基因發(fā)生了突變〔12〕。另外，研究發(fā)現(xiàn)〔1〕MPTP和其他外源性殺蟲劑也可以損傷線粒體復(fù)合體Ⅰ的功能。無論如何，線粒體功能障礙都可導(dǎo)致ATP水平的降低，誘發(fā)自由基生成，最終使神經(jīng)元凋亡。
4 PD神經(jīng)元凋亡的基因調(diào)控〔13〕
�、賐cl?2家族，Ziv等用PC12細胞系研究發(fā)現(xiàn)bcl?2能明顯抑制DA氧化產(chǎn)物的生成,并且能阻止細胞內(nèi)GSH水平下降。Hassouna等發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)腹膜注射MPTP后，其腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)bax mRNA合成增加，注藥后3 d和6 d分別達到正常的2倍和3倍，在黑質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)相應(yīng)bax免疫反應(yīng)性的大、中型神經(jīng)元都發(fā)生了壞死。說明MPTP可誘發(fā)bax表達,促進凋亡的發(fā)生。②p53，p53激活可介導(dǎo)DA誘導(dǎo)細胞凋亡。③c?jun、c?fos轉(zhuǎn)錄因子c?jun、c?fos被認為在神經(jīng)細胞凋亡誘導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。但在多種PCD過程中確實存在c?fos的過度表達，但到底是c?fos引起PCD還是PCD同時伴有c?fos的增多，到目前為止還沒有確證。④caspase中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元的缺失是PD的主要病理特點。檢測PD患者死亡后腦組織時發(fā)現(xiàn)，中腦多巴胺能神經(jīng)元的丟失與Caspase?3陽性神經(jīng)元呈正相關(guān)。在MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD模型中，Caspase?3的激活在第1、2天即達高峰，但是到第7天時DA能神經(jīng)元的丟失才會很明顯,說明Caspase的激活是DA能神經(jīng)元凋亡過程的早期信號。Caspase?3是PD患者和PD動物模型黑質(zhì)DA能神經(jīng)元凋亡的易感因子和效應(yīng)器〔14〕。
綜上所述，PCD作為PD的發(fā)病機制學(xué)說之一，在一定程度上被研究者證實，但人們對于PD病人腦內(nèi)的DA能神經(jīng)元是否發(fā)生凋亡依然存在爭論，這主要有三方面的原因：①PD的病程較長，同一時間內(nèi)發(fā)生退變的神經(jīng)元數(shù)量很少，而典型的PCD形態(tài)也只能保持幾天，所以在任何一個時間點去觀察都很難找到凋亡的形態(tài)學(xué)證據(jù);②尸檢的標(biāo)本多來自于晚期PD病人，此時病變的DA能神經(jīng)元大都已經(jīng)缺失，難以檢測;③判定凋亡的標(biāo)準過于單一，多數(shù)的研究僅采用形態(tài)學(xué)標(biāo)準，而單一的形態(tài)學(xué)方法無法準確區(qū)分凋亡與壞死。最常用來檢測DA能神經(jīng)元凋亡的方法為TUNEL法，目前認為單純使用TUNEL法檢測病人腦組織所取得的結(jié)果可信度很低，例如氧化應(yīng)激導(dǎo)致細胞壞死的同時也有DNA的斷裂，TUNEL檢測為假陽性;處于有絲分裂期的膠質(zhì)細胞可以被d?UTP標(biāo)記，導(dǎo)致假陽性結(jié)果;死后的腦組織如果不能被及時固定會增加非特異性標(biāo)記，呈假陽性結(jié)果，如果固定時間過長引起蛋白質(zhì)交聯(lián)則呈假陰性結(jié)果;Ca2+和 Mg2+等二價陽離子可以提高d?UTP與DNA 3′末端的親合力，微小的濃度變化對結(jié)果有較大的影響;核酸內(nèi)切酶的種類較多，作用于DNA產(chǎn)生各種不同的形狀的殘端，而末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶與不同的DNA殘端結(jié)合能力差別較大，使結(jié)果變得不穩(wěn)定。
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