瘧原蟲抗藥性的遺傳學(xué)研究進(jìn)展

瘧原蟲抗藥性的遺傳學(xué)研究進(jìn)展 關(guān)鍵詞：瘧原蟲屬；抗瘧藥；抗藥性；基因

　　摘　要　瘧原蟲產(chǎn)生抗藥性是瘧疾防治中遇到的主要難題之一�？谷~酸類抗瘧藥的抗藥性機(jī)制已基本搞清，與其作用靶酶二氫葉酸還原酶或二氫蝶酸合成酶基因點(diǎn)突變相關(guān)。喹啉類藥物抗性影響因子尚不完全清楚。惡性瘧原蟲5號染色體上的多藥耐藥基因1及7號染色體上的cg2基因可能是抗性相關(guān)基因，但二者都不能完全解釋抗性，尚待深入研究。
　　瘧疾的流行至今仍然十分廣泛，遍及全球90多個國家和地區(qū)，20億人面臨感染瘧疾的危險。據(jù)統(tǒng)計，全球每年有3億～5億瘧疾病例，導(dǎo)致150萬～270萬人死亡，其中100萬是居住在非洲的5歲以下兒童［1］。人類在長期實(shí)踐過程中篩選了大量防治瘧疾的藥物，但是，自從50年代末在東南亞和南美洲分別發(fā)現(xiàn)惡性瘧原蟲對氯喹產(chǎn)生抗藥性以后，抗氯喹惡性瘧迅速擴(kuò)散蔓延，抗藥性程度不斷增加，并且從單藥抗藥性向多藥抗藥性發(fā)展。我國的海南、云南和廣西等省、自治區(qū)也有抗藥性瘧疾的流行。目前，瘧原蟲對幾乎每一種抗瘧藥都產(chǎn)生了抗性，瘧疾防治形勢非常嚴(yán)峻，迫切要求我們盡快搞清抗藥性產(chǎn)生的機(jī)制，以便采取措施防止或逆轉(zhuǎn)抗藥性的發(fā)生并指導(dǎo)新藥研究。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及學(xué)科滲透大大推動了瘧原蟲抗藥性機(jī)制的遺傳學(xué)研究，本文就抗葉酸制劑及喹啉類藥物抗性的分子機(jī)制作一綜述。
　　1　抗葉酸制劑抗性的分子機(jī)制
　　1.1　二氫葉酸還原酶（DHFR）基因
　　乙胺嘧啶和環(huán)氯胍都是二氫葉酸還原酶抑制劑。研究表明，惡性瘧原蟲對兩藥產(chǎn)生抗藥性都與DHFR基因點(diǎn)突變相關(guān)，但二者存在差異［2,3］。迄今為止，共報道了6個DHFR基因編碼區(qū)變異：108位Ser→Asn或Thr,51位Asn→Ile,59位Cys→Arg,16位Ala→Val,164位Ile→Leu。單一點(diǎn)突變所致DHFR108位Ser變異成Asn即可產(chǎn)生乙胺嘧啶抗性，但對環(huán)氯胍的反應(yīng)性僅稍有降低。對乙胺嘧啶產(chǎn)生高度抗性則需其他位點(diǎn)突變共存，包括51位Asn→Ile和（或）59位Cys→Arg。而與環(huán)氯胍抗性相關(guān)的變異是DHFR108位Ser→Thr伴隨16位Ala→Val，同樣，該抗性株對乙胺嘧啶的敏感性變化不大。
　　另外，在對乙胺嘧啶和環(huán)氯胍交叉耐藥的惡性瘧原蟲中發(fā)現(xiàn)存在多個位點(diǎn)變異：DHFR164位Ile→Leu,108位Ser→Asn,59位Cys→Arg和（或）51位Asn→Ile。由于僅包含Asn-108和Arg-59變異的原蟲分離物不具有環(huán)氯胍抗性，因此，認(rèn)為Leu-164變異在瘧原蟲對兩藥產(chǎn)生交叉抗性的機(jī)制中起重要作用［3］。
　　1.2　二氫蝶酸合成酶（DHPS）基因
　　磺胺類藥是二氫蝶酸合成酶抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，正是由于磺胺類藥作用的靶酶DHPS基因點(diǎn)突變，使得酶活性中心結(jié)構(gòu)域形狀改變，因而降低了對藥物的敏感性。體外低葉酸條件下實(shí)驗(yàn)表明［4］，與磺胺多辛易感性降低相關(guān)的DHPS氨基酸變異主要包括581位Ala→Gly,436位Ser→Phe伴隨613位Ala→Thr/Ser,以及436位Ser→Ala,437位Ala→Gly。
　　磺胺多辛通常與乙胺嘧啶合用于治療惡性瘧疾。對兩藥聯(lián)用的體外研究揭示，瘧原蟲對乙胺嘧啶的易感性決定著兩藥協(xié)同作用的效果［5］。體內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)［6］，前面所述的DHFR變異類型均存在并與抗性程度相關(guān)，而DHPS基因突變與抗性的發(fā)生沒有明顯相關(guān)性，僅在抗性程度較高的玻利維亞地區(qū)可見Gly-581高度流行,Gly-437和Glu-540的發(fā)生與用乙胺嘧啶-磺胺多辛治療失敗率相當(dāng)，這可能由于體外研究中葉酸和PABA水平不同于體內(nèi)。另一種解釋是Ala-436的變異可能僅在低度抗性時出現(xiàn)，且不與高度抗性時的變異Gly-437,Glu-540和Gly-581共存。因此推測，DHPS變異在臨床乙胺嘧啶-磺胺多辛抗性的產(chǎn)生中不起主導(dǎo)作用。
　　我們能夠肯定，體內(nèi)乙胺嘧啶-磺胺多辛抗性與DHFR基因突變相關(guān)，然而在抗性瘧流行區(qū)治療失敗率并不像突變發(fā)生率那樣高，提示體外研究發(fā)現(xiàn)的三種變異Asn-108，Ile-51和Arg-59不能完全解釋體內(nèi)高度抗性。在玻利維亞的高度抗性病例中曾發(fā)現(xiàn)Leu-164及另外兩個新的變異Arg-50和插入30-31位間的玻利維亞重復(fù)區(qū)高度流行，提示這些變異可能是在抗性發(fā)展的較高時期產(chǎn)生的，關(guān)系到治療的成敗。據(jù)此Plowe等［6］提出假設(shè)，體內(nèi)乙胺嘧啶-磺胺多辛抗性程度分級RⅠ,RⅡ,RⅢ正是基于DHFR和DHPS基因突變的不斷積累。由于現(xiàn)實(shí)中惡性瘧原蟲感染的復(fù)雜性及宿主免疫與葉酸水平的影響，事實(shí)上所檢測到的抗性突變往往是交叉重疊的。
　　總之，關(guān)于抗葉酸制劑的抗藥性分子機(jī)制已基本搞清。因此，我們可以根據(jù)特有的突變類型，運(yùn)用分子生物學(xué)的方法，進(jìn)行大規(guī)模的流行病學(xué)研究，這對于鑒定某一瘧疾流行區(qū)的藥物敏感性，從而指導(dǎo)臨床用藥具有重要意義；同時也可指導(dǎo)新藥設(shè)計及臨床藥物聯(lián)用，以最大限度地減少藥物抗性的發(fā)生。
　　2　喹啉類藥物抗性的分子機(jī)制
　　氯喹曾經(jīng)是使用最廣泛的抗瘧藥，由于抗性的發(fā)展及傳播，在大部分地區(qū)已不再具有以往的效力。影響抗性機(jī)理最終闡明的重要因素是喹啉類藥物作用機(jī)制還不十分清楚。不同地區(qū)的研究者報道關(guān)于氯喹抗性的一個共同特征是：抗氯喹蟲株較敏感性蟲株藥物聚集水平降低了。因此，氯喹的轉(zhuǎn)運(yùn)和聚集不僅對其發(fā)揮抗瘧活性是必需的，而且與抗性表型密切相關(guān)，提示喹啉類藥物抗性產(chǎn)生可能與其作用方式?jīng)]有直接關(guān)系，這與抗葉酸制劑不同。
　　2.1　惡性瘧原蟲多藥耐藥基因（pfmdr1和pfmdr2）
　　研究發(fā)現(xiàn)，維拉帕米（一種鈣通道阻滯劑）可逆轉(zhuǎn)氯喹抗藥性，促使人們考慮氯喹抗性可能與哺乳動物腫瘤細(xì)胞多藥抗藥性（MDR）表型相似［7］。研究表明，腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MDR是由于一種ATP依賴性的、與藥物外排相關(guān)的蛋白過量表達(dá)所致，稱為P-糖蛋白，它定位于細(xì)胞表面，與許多不同類型的化合物有親合力［8］。在此基礎(chǔ)上，Krogstad等［9］發(fā)現(xiàn)抗氯喹株原蟲較敏感株排出氯喹的速率快40～50倍，且這種排出是能量依賴性的，并可被能量缺乏及ATP阻斷劑抑制。但是也有研究顯示,抗氯喹株與敏感株藥物外排率相等［10］；二者藥物聚集量的差別是由于最初的藥物攝入速率不同所致［11］。
　　哺乳動物MDR表型通常伴有mdr基因的擴(kuò)增，導(dǎo)致其產(chǎn)物P-糖蛋白表達(dá)增加［8］。對惡性瘧原蟲基因的研究表明也存在mdr基因同系物，以pfmdr1和pfmdr2為主［12，13］。目前尚無證據(jù)表明pfmdr2及其表達(dá)產(chǎn)物與氯喹抗性有關(guān)，而有相當(dāng)多的研究認(rèn)為pfmdr1與抗藥性機(jī)制相關(guān)。
　　Pfmdr1編碼一個相對分子質(zhì)量約162的蛋白，稱為P-糖蛋白同系物1（Pgh1）。早期研究表明，在一些抗氯喹株中存在pfmdr1擴(kuò)增［12，13］。免疫熒光及免疫電鏡技術(shù)觀察pfmdr1蛋白產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)Pgh1在紅內(nèi)期表達(dá)，主要定位于食物泡膜上，這與它可能充當(dāng)氯喹轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的角色一致，但是定量分析不能確認(rèn)Pgh1過表達(dá)與抗藥性相關(guān)［14］。
　　Foote等［15］對pfmdr1基因3′多態(tài)性及等位基因變異分析表明，pfmdr1突變與氯喹抗性表型相關(guān)，并提出存在兩種類型抗性相關(guān)等位基因，一種可致單一氨基酸變異86位Asn→Tyr，為K1型；另一種則導(dǎo)致三種氨基酸變異，1034位Ser→Cys、1042位Asn→Asp和1246位Asp→Try,為7G8型。這可能分別代表著最早在東南亞和南美洲出現(xiàn)的氯喹抗性類型。以此為基礎(chǔ)，運(yùn)用單盲法研究，曾正確地預(yù)測了36份樣品中的34份的藥物易感性。Adagu等［16］的研究也表明86位Tyr突變與氯喹抗性相關(guān)。但是，同時有些研究不能得到相同的結(jié)果。這提示可能pfmdr1不是唯一的控制抗性的基因。
　　氯喹抗性與pfmdr1的關(guān)系尚不明確，從選自氯喹抗性親代的甲氟喹抗性株中卻發(fā)現(xiàn)有pfmdr1的擴(kuò)增，并且蟲株對甲氟喹抗性增加的同時對氯喹的易感性增加了［12］。Barnes等［17］的研究表明，隨著原蟲對氯喹抗性的增加，pfmdr1基因拷貝數(shù)減少，甲氟喹易感性增加，這無疑加強(qiáng)了pfmdr1擴(kuò)增與甲氟喹抗性的關(guān)聯(lián)。因此推測pfmdr1擴(kuò)增可能與氯喹高度抗性是不相容的，Pgh1的功能可能是促進(jìn)對氯喹的易感性。
　　將pfmdr1基因轉(zhuǎn)染于異源表達(dá)系統(tǒng)中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO），使其表達(dá)惡性瘧原蟲Pgh1，發(fā)現(xiàn)Pgh1表達(dá)伴隨有能量依賴性的藥物攝入增加［18］，而且Pgh1就定位于轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞溶酶體上，經(jīng)測定，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞溶酶體內(nèi)pH值有所下降，認(rèn)為氯喹聚集增加可能是溶酶體酸化的結(jié)果，推測pfmdr1可能編碼一種液泡氯化物通道。當(dāng)CHO細(xì)胞被攜帶有7G8型1034和1042位突變的pfmdr1基因轉(zhuǎn)染時，則發(fā)現(xiàn)氯喹易感性喪失，細(xì)胞聚集藥物及酸化溶酶體的能力減弱，這就從某種意義上證實(shí)了關(guān)于Pgh1促進(jìn)氯喹易感性的推測。但這仍不足以解釋抗性。Ritchie等［19］發(fā)現(xiàn)源自氯喹抗性親代的鹵泛曲林抗株表現(xiàn)對鹵泛曲林、甲氟喹和奎寧敏感性降低而對氯喹敏感性增強(qiáng)，卻未檢測到任何pfmdr1基因序列或拷貝數(shù)及Pgh1表達(dá)的變化。
　　很明顯，關(guān)于pfmdr1與喹啉類藥物抗性的關(guān)系仍有很大疑問，可能抗性的發(fā)生有一定的地理學(xué)基礎(chǔ)，而尋找某個單一的基因來解釋抗性本身過于簡單化，氯喹抗性發(fā)生的緩慢及復(fù)雜性也不支持單基因決定抗性的假設(shè)。

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