VPA解除Met對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元GAD表達的抑制

VPA解除Met對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元GAD表達的抑制 【摘要】 目的 研究丙戊酸(VPA)、蛋氨酸(Methionine，Met)對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元谷氨酸脫羧酶(GAD)表達的影響，探討VPA對精神分裂癥的治療作用。方法 采用原代培養(yǎng)技術(shù)分組培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，收集細胞、制備GAD粗酶提取液，用比色法測定粗酶提取液GAD活力；分析空白組（無血清培養(yǎng)液）、Met組（無血清培養(yǎng)液含終濃度為2mM的Met培養(yǎng)3天后換以無血清培養(yǎng)液）、VPA組（無血清培養(yǎng)液含終濃度為2mM的Met培養(yǎng)3天后換以終濃度為0.5mM的VPA 無血清培養(yǎng)液）的GAD活性。結(jié)果 Met組GAD平均酶活力明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而VPA組的GAD平均酶活力接近于空白組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 蛋氨酸抑制大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元表達GAD，降低GABA的合成；VPA促進皮質(zhì)神經(jīng)元表達GAD，可以使被Met抑制的GAD恢復(fù)到正常水平。

【關(guān)鍵詞】 丙戊酸；蛋氨酸；谷氨酸脫羧酶；精神分裂癥

Valproate renew GAD expression which had been inhibited by methionine in mouse primary cortical cultures

【Abstract】 Objective To study valproate and methionine(Met) regulate glutamic acid decarboxylase (GAD) expression in mouse primary cortical cultures nouron，investigate the mechanism of the VPA’s function in the treatment of schizophrenia.Methods Adopting primary cortical cultures technique cultures neuron，collecte cells，lysis cells，use colorimetric method to measure GAD activities；analyse GAD activities of the vacancy group（serum-free DMEM），the Met group（cultures were incubated with Met at a final concentration of 2 mM in serum-free DMEM for 3days，after that change it with serum-free DMEM），and the VPA group（cultures were incubated with VPA at a final concentration of 2 mM in DMEM after that incubated with Met at a final concentration of 2 mM in serum-free DMEM for 3days）.Results In the Met group the average activities of GAD is obviously lower than the other two group，the difference has statistical meaning. In the VPA group the average activities of GAD is approach to vacancy group，the difference hasn’t statistical meaning.Conclusion The methionine inhibits the cortical neuron express GAD，decreases GABA synthesize. The VPA promotes the cortical neuron expression GAD，and renews GAD expression which had been inhibited by Met in mouse primary cortical cultures.

【Key words】 valproate；methionine；glutamic acid decarboxylase（GAD）；schizophrenia

增加蛋氨酸（Methionine，Met）的攝入量，會造成近百分之七十的精神分裂癥（schizophrenia，SZ）患者癥狀惡化［1］。有學(xué)者認為的大量攝入Met引起大鼠體內(nèi)活性甲基供給體S-腺苷同型半胱氨酸（SAM）增加，SAM使谷氨酸脫羧酶(glutamic acid decarboxylase.GAD)等基因啟動區(qū)甲基化修飾，引起GAD等基因表達降低［2］。在美國醫(yī)生普遍使用丙戊酸(valproic acid，VPA）輔助治療SZ。2001年Christopher［3］發(fā)現(xiàn)VPA能抑制組蛋白去乙�；�酶（Histone Deacetylase，HDACs)的活性，從而誘導(dǎo)基因表達。筆者通過原代培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，并在培養(yǎng)液中先后加入Met、VPA，然后用Berthelot［4］ 反應(yīng)測定不同組別的皮質(zhì)神經(jīng)元裂解液的GAD相對酶活性。如果Met 能抑制GAD基因表達，將使皮質(zhì)神經(jīng)元中GAD的相對酶活性降低，而如果VPA能誘導(dǎo)GAD基因表達，將使GAD恢復(fù)到正常水平。

1 材料與方法

1.1 試劑 多聚左旋賴氨酸，N2添加劑(100×的成分: 牛胰島素500μg/ml，人轉(zhuǎn)鐵蛋白10000μg/ml，黃體酮0.63μg/ml，硒0.52μg/ml，腐胺 1611μg/ml，Gibco)，基礎(chǔ)培養(yǎng)液（DMEM、碳酸氫鈉、青霉素、鏈霉素），胎牛血清，兔抗GABA 血清(1∶600)，羊抗兔IgG (1∶40)，免疫組織化學(xué)試劑盒，Met、Gly 標準品，苯甲基磺酰氟(PMSF)，非變性條件下裂解細胞的裂解液（pH 7.0的20mM Tris，150mM NaCl，1% Triton X-100，焦酸鈉，β-甘油磷酸，EDTA，Na3VO4，等），GABA (純度99.9 %)，5′-磷酸吡哆醛(PLP)，L-谷氨酸鈉 (L-MSG)，次氯酸鈉，F(xiàn)olin－酚試劑，牛血清白蛋白，巰基乙醇，重蒸酚，無水乙醇等。

1.2 動物 孕期16～18天清潔級SD大鼠，由鄭州大學(xué)動物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元分組培養(yǎng) 大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的體外培養(yǎng)參照陳麗敏［5］ 完全培養(yǎng)液組的培養(yǎng)方法。以5×105/孔的數(shù)量接種大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元于多聚左旋賴氨酸處理過的24孔培養(yǎng)板。以新配制的完全培養(yǎng)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)液 N2添加劑 10%胎牛血清)培養(yǎng)細胞，3天后換以無血清培養(yǎng)液（基礎(chǔ)培養(yǎng)液 N2添加劑）分組繼續(xù)培養(yǎng)。實驗分三組，每組8個孔:空白組，無血清培養(yǎng)液；Met組，無血清培養(yǎng)液含終濃度為2mM的MET，培養(yǎng)3天后換以無血清培養(yǎng)液；VPA組，無血清培養(yǎng)液含終濃度為2mM的Met，培養(yǎng)3天后換以終濃度為0.5mM的VPA的無血清培養(yǎng)液。將細胞放置于溫度37℃、體積分數(shù)為5%CO2、飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分組培養(yǎng)6天后將細胞用于各類實驗。

1.3.2 GABA能神經(jīng)元的免疫細胞化學(xué)(PAP法)鑒定 培養(yǎng)細胞用4%多聚甲醛固定，0.2% Triton X-100和0.03% H2O2/甲醇溶液于室溫下處理30min，羊血清蛋白(1∶50)37℃ 1h，經(jīng)兔抗GABA血清(1∶600)4℃孵育72h，再經(jīng)羊抗兔IgG(1∶40)37℃ 1h，兔抗PAP復(fù)合物(1∶40)37℃ 1h，用DAB 4HCl/H2O2(0.05%/0.01%)呈色35min，貼片、脫水、透明及封片。上述每步驟間均用PBS充分洗滌，光鏡下觀察。

1.3.3 谷氨酸脫羧酶活性的測定 （1）粗酶提取液的制備：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水（含最終濃度為1mM的PMSF）洗一遍細胞。每孔加入100μl非變性條件下裂解細胞的裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細胞充分接觸。裂解液接觸細胞2s后，細胞就會被裂解。于4000r/min 下離心5min，得到的上清液即為粗酶液。裂解細胞的所有步驟都在冰上進行。采用Lowry 法測定蛋白質(zhì)濃度后，用磷酸鹽緩沖液稀釋到3g蛋白/L。冰箱短時間保存?zhèn)溆谩＃?）采用比色法測定粗酶提取液谷氨酸脫羧酶的活性：取0.2ml 50mmol/L的磷酸緩沖液(pH 6.8)，其中含5mmol/L L-MSG及0.2mmol/L 的PLP，加入0.1ml 待測粗酶提取液和0.1ml 蒸餾水（對照組加入0.1ml 2mM的Met，實驗組加入0.1ml 2mM的Gly），于37℃水浴中保溫30min；迅速置于冰浴中止反應(yīng)，加入0.2ml 0.2mmol/L pH 9.0 的硼酸緩沖液，1ml 6%的重蒸酚溶液，0.4ml次氯酸鈉溶液，充分振蕩；沸水浴10min 后，冰浴20min不斷振蕩，直至有藍綠色化合物出現(xiàn)，然后加入2ml 60%的乙醇于645nm 下比色。以已知濃度的GABA 作對照。在上述測定條件下，以每分鐘生成1μmol 的GABA 所需的酶量為一個酶活單位(U)。每組測定同時做3次重復(fù)，求平均值。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)以（x±s）表示，采用SPSS10.0 統(tǒng)計軟件，平均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有顯著性。

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