干細(xì)胞的研究進(jìn)展

干細(xì)胞的研究進(jìn)展 【摘要】 干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞群體。近年來(lái)干細(xì)胞的應(yīng)用幾乎涉及到所有生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本文概述了干細(xì)胞的生物學(xué)特性，并綜述了干細(xì)胞的可塑性、分離培養(yǎng)及其在基礎(chǔ)研究及臨床上的應(yīng)用的研究進(jìn)展。最后，展望了今后研究的方向。

　　【關(guān)鍵詞】 干細(xì)胞；生物學(xué)特性；可塑性；分離培養(yǎng)；應(yīng)用

　　Advances in study of stem cells

　　【Abstract】 Stem cells are non-specialized cells which have the ability of self-renewal and multiple differentiation potential. The application of stem cells has nearly involved in all the research field on life sciences and biomedicine in recent years. This article summarizes the biological characteristic of stem cells, and reviews the latest progress in the study on stem cell’s plasticity, isolation, culture in vitro, and its extensive application in basic research and clinical application. The prospects of stem cells are also discussed.

　　【Key words】 stem cells; biological characteristic; plasticity; isolation; culture in vitro; application

干細(xì)胞（stem cells）是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體，即這些細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞分裂維持自身細(xì)胞群的大小，同時(shí)又可以進(jìn)一步分化成為各種不同的組織細(xì)胞，從而醫(yī)學(xué)界稱之為“萬(wàn)用細(xì)胞”。1981年英國(guó)的Evans和Kaufman用延緩著床的胚泡首次成功地分離了小鼠胚胎干細(xì)胞,從而在全球掀起了有關(guān)干細(xì)胞的研究熱潮。1997年2月英國(guó)蘇格蘭羅斯林研究所威爾穆特博士等成功克隆出“多利”綿羊，1998年11月,美國(guó)Thomson［1］和Gearhart［2］分別用不同的方法獲得人胚胎干細(xì)胞及胚胎生殖細(xì)胞,此后,干細(xì)胞的研究便進(jìn)入了一個(gè)全新的時(shí)代。1999年，有關(guān)干細(xì)胞的研究被Science評(píng)為1999年度十大科學(xué)進(jìn)展之首。2000年12月干細(xì)胞研究再次被《科學(xué)》雜志評(píng)為該年度世界十大科學(xué)成就之一。本文就近幾年來(lái)干細(xì)胞的研究進(jìn)展綜述如下。

　　1 干細(xì)胞的生物學(xué)特性

　　根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育階段，可將其分為胚胎干細(xì)胞（Embryonic Stem Cell,ES）和成體干細(xì)胞（Adult Stem Cell，AS）。胚胎干細(xì)胞即具有分化為機(jī)體任何一種組織器官潛能的細(xì)胞,包括胚胎干細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞（Embryonic Germ Cell，EG）。成體干細(xì)胞即具有自我更新能力,但通常只能分化為相應(yīng)組織器官組成的“專業(yè)”細(xì)胞,它是存在于成熟個(gè)體各種組織器官中的干細(xì)胞,包括神經(jīng)干細(xì)胞（Neural Stem Ce11，NSC）、血液干細(xì)胞（Hematopoietic Stem Cell，HSC）、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）、表皮干細(xì)胞（EPidexmis Stem Cell）、肝干細(xì)胞（Hepatic Stem Cell）等。

　　1.1 胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性 　 胚胎干細(xì)胞最早是直接從小鼠早期胚胎分離建系的,它們具有其自身的生物學(xué)特性。與其他細(xì)胞系相比較, 胚胎干細(xì)胞的特點(diǎn)在于:（1）具有不斷增殖分化的能力，所以，在體外培養(yǎng)條件下可以建立穩(wěn)定的干細(xì)胞系，并保持高度未分化狀態(tài)和發(fā)育潛能性。1999年Soiter等［3］利用這個(gè)特性將ES/EBs及其分化細(xì)胞作為有關(guān)藥物的針對(duì)篩選系統(tǒng),進(jìn)行藥物毒性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。（2）具有高度的發(fā)育潛能和分化潛能。體內(nèi)外可分化出外、中、內(nèi)三個(gè)胚層的分化細(xì)胞，可以誘導(dǎo)分化為成體細(xì)胞內(nèi)各種類型的組織細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞含有正常二倍染色體，具有種系傳遞功能,能廣泛參與宿主胚胎各組織器官的生長(zhǎng)發(fā)育,并形成包括生殖系在內(nèi)的合體后代生殖細(xì)胞。1995年P(guān)acacio等［4］利用骨髓基質(zhì)細(xì)胞或其培養(yǎng)液,將胚胎干細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化為造血干細(xì)胞。1997年Baker等［5］在缺乏新霉素(geneticin,g418)的條件下,將Rosaβ-geo基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞后能在體外誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞。同年Deni等報(bào)告將胚胎干細(xì)胞通過(guò)懸滴培養(yǎng)可分化出脂肪細(xì)胞。（3）能進(jìn)行體外培養(yǎng)擴(kuò)增,還可以對(duì)其進(jìn)行遺傳操作選擇, 如導(dǎo)入異源基因、報(bào)告基因或標(biāo)志基因，誘導(dǎo)某個(gè)基因突變等。擴(kuò)增、遺傳操作及凍存均不喪失其多能性。凍存的細(xì)胞可在需要時(shí)隨時(shí)解凍,繼續(xù)培養(yǎng)不失其原有特性。

　　1.2 成體干細(xì)胞的生物學(xué)特征 　　干細(xì)胞在分化為特化細(xì)胞之前常產(chǎn)生一種或幾種祖細(xì)胞，然后由祖細(xì)胞分化產(chǎn)生特化細(xì)胞。與胚胎干細(xì)胞相比較，成體干細(xì)胞有以下幾個(gè)特點(diǎn)：(1)成體干細(xì)胞體積小，細(xì)胞器稀少，RNA含量較低，在增殖過(guò)程中處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，在組織結(jié)構(gòu)中位置相對(duì)固定。(2)成體干細(xì)胞數(shù)量很少，其基本功能是參與組織更新，創(chuàng)傷修復(fù)及維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。研究結(jié)果表明，即使在含量豐富的骨髓中，每10，000～15，000個(gè)骨髓細(xì)胞中只有一個(gè)造血干細(xì)胞［6］，人和動(dòng)物皮膚中的干細(xì)胞含量?jī)H為7%～8％［7］。Reynolds等［8］實(shí)驗(yàn)證明成體哺乳動(dòng)物腦內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量極少，僅占室下帶區(qū)中相對(duì)靜止細(xì)胞數(shù)的0.1%～1%。(3)成體干細(xì)胞常處于一個(gè)有干細(xì)胞細(xì)胞基質(zhì)，對(duì)干細(xì)胞的增殖和分化起調(diào)控作用的各種信號(hào)分子的特定微環(huán)境或稱生物位（nich）中，干細(xì)胞是自我復(fù)制還是分化為功能細(xì)胞取決于所在的微環(huán)境和自身的功能狀態(tài)。(4)成體干細(xì)胞沒(méi)有確定的來(lái)源。有科學(xué)家推測(cè)，成體干細(xì)胞是胚胎發(fā)育過(guò)程中保存下來(lái)的未分化的細(xì)胞［6］，這揭示成體干細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞可能會(huì)有更多的相似性與同源性。

　　2 干細(xì)胞的可塑性

干細(xì)胞的可塑性主要是指成體干細(xì)胞的可塑性。人們把成體干細(xì)胞具有分化為其他類型組織細(xì)胞的能力的這種現(xiàn)象稱為干細(xì)胞的可塑性（plasticity）［9］，橫向分化（transdifferentiation）［10］或轉(zhuǎn)決定（transdetermination）［11］。

　　1995年，Pereira等［12］證明，小鼠骨髓細(xì)胞在體外培養(yǎng)后具有向骨、軟骨和肺基質(zhì)轉(zhuǎn)化的能力。1999年,Bjornson等［13］將胚胎和成年小鼠神經(jīng)干細(xì)胞,以及在體外克隆的神經(jīng)干細(xì)胞移植給亞致死劑量照射的小鼠,結(jié)果證明神經(jīng)干細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為造血細(xì)胞。同年Jackson等［14］用 Hoechst333422-lowSP純化的小鼠造血干細(xì)胞進(jìn)一步證明它可遷移到肌肉損傷部位,在參與肌肉再生的同時(shí)也參與血管的再生。2002年Vescovi 等［15］報(bào)道神經(jīng)干細(xì)胞除有向神經(jīng)元、星形細(xì)胞與少突膠質(zhì)細(xì)胞分化能力以外,還可分化為造血細(xì)胞譜系。
　　
　　肝干細(xì)胞也是干細(xì)胞可塑性的主要可靠證據(jù)之一。2000年Alison等［16］和Lagasse等［17］分別報(bào)道HSC可在體內(nèi)分化成肝細(xì)胞。2001年Shen等［18］在骨髓移植的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),肝臟干細(xì)胞能表達(dá)供體造血細(xì)胞的遺傳標(biāo)志。
　　
　　這一系列的證據(jù)表明干細(xì)胞存在可塑性。然而，近幾年來(lái)，部分研究學(xué)者對(duì)干細(xì)胞的可塑性提出了不同的看法:(1)細(xì)胞自發(fā)融合導(dǎo)致“可塑性”。英國(guó)科學(xué)家2002年,Ying等［19］的研究結(jié)果表明, 胚胎干細(xì)胞在體外與神經(jīng)或HSC共同培養(yǎng)時(shí),能自發(fā)地發(fā)生神經(jīng)或HSC與胚胎干細(xì)胞之間的融合,誘導(dǎo)NSC或HSC“橫向分化”為胚胎樣干細(xì)胞,然后展現(xiàn)出胚胎干細(xì)胞的表型特征與相應(yīng)功能。同年美國(guó)科學(xué)家Terada等［20］用充分的證據(jù)證明,骨髓細(xì)胞的多向分化是因?yàn)榕c胚胎干細(xì)胞融合所致,而不是骨髓細(xì)胞直接橫向分化的結(jié)果。這兩者的研究結(jié)果都表明，是由于發(fā)生了細(xì)胞融合，使所謂的成年組織干細(xì)胞具有了“可塑性”潛能。(2)成體干細(xì)胞的橫向分化是成體組織中余存的胚胎原始干細(xì)胞所致。2002年Jiang等［21］的研究結(jié)果證實(shí),在成體組織中余存著一種數(shù)量稀少的胚胎樣原始干細(xì)胞,表達(dá)胚胎干細(xì)胞的標(biāo)志如Oct-4、Rex-1及SSEA-1,體外培養(yǎng)條件也類似于胚胎干細(xì)胞,所謂的成體組織干細(xì)胞的“可塑性”很可能是這些細(xì)胞所為。(3)2002年，在Science和Nature上連續(xù)刊發(fā)的幾篇文章指出，成體干細(xì)胞可塑性可能是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不嚴(yán)謹(jǐn)，判斷錯(cuò)誤所致，認(rèn)為所謂的成體干細(xì)胞可塑性缺乏科學(xué)依據(jù)。

　　3 干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

　　由于干細(xì)胞的數(shù)目很少，因此需要在體外對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行非分化性增殖。干細(xì)胞的分離培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)是其生物學(xué)特征，包括形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征及其生物學(xué)表型。

　　干細(xì)胞的分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)主要是建立在老鼠的實(shí)驗(yàn)上，早在二十世紀(jì)七八十年代就已從小鼠中分離出胚胎干細(xì)胞并在體外進(jìn)行培養(yǎng)成功。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)在這方面的研究也取得了一定的進(jìn)展，主要是在神經(jīng)干細(xì)胞等成體干細(xì)胞的研究上。2002年陳雷等［22］應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)從胎鼠脊髓分離到的神經(jīng)系統(tǒng)的干細(xì)胞具有不斷分裂增殖的能力, 可被神經(jīng)干細(xì)胞特異性抗體所標(biāo)記, 并在血清條件下分裂為神經(jīng)系統(tǒng)多種細(xì)胞。2004年馮玉萍等［23］用胰酶消化加機(jī)械吹打分離大鼠大腦皮質(zhì)及皮質(zhì)下組織,之后用懸浮培養(yǎng)法、有限稀釋法獲得來(lái)源于同一細(xì)胞的亞細(xì)胞系克隆; 2005年肖美玲等［24］用同樣的方法分離新生昆明種小鼠(出生24 h 內(nèi)) 的大腦組織，利用無(wú)血清培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)細(xì)胞,獲得具有自我增殖能力的細(xì)胞克隆,兩者經(jīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定為神經(jīng)干細(xì)胞。

　　雖然老鼠的干細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)取得了可喜的進(jìn)展，但人的干細(xì)胞的體外培養(yǎng)直到1995年,Thomson等從恒河猴的囊胚中分離,建立了第一個(gè)靈長(zhǎng)類動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞株后，才獲得成功并得到迅速的發(fā)展。1998年,Thomson［1］和Gearhart［2］分別用胚胎干細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞建立了人的胚胎干細(xì)胞系,在體細(xì)胞與生殖細(xì)胞間架起了橋梁,為研究胚胎干細(xì)胞的發(fā)育,在體外培養(yǎng)人體細(xì)胞和組織,利用ES細(xì)胞治療疾病提供了廣闊的發(fā)展前景。在報(bào)道分離了人的胚胎干細(xì)胞這一重大成果后不久,美國(guó)Advance Cell Technology (ACT, Worcester, M)的研究者宣稱,他們通過(guò)使人的皮膚細(xì)胞和牛的卵細(xì)胞雜交,培育出了人的胚胎干細(xì)胞。所用的方法與克隆實(shí)驗(yàn)中采用的方法相似,基本上是對(duì)人的細(xì)胞重新編程并使其回到它最初的原始狀態(tài)。該發(fā)現(xiàn)可能導(dǎo)致許多新方法的產(chǎn)生,如通過(guò)移植和細(xì)胞治療來(lái)醫(yī)治疾病。2002年李巍等［25］采用無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù), 成功地分離培養(yǎng)了人胚胎大腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞，且能被誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。經(jīng)傳12代后仍具干細(xì)胞特性。2004年王共先等［26］以器官捐獻(xiàn)者的正常前列腺為研究對(duì)象,利用免疫磁珠細(xì)胞成功從前列腺基底細(xì)胞中分離前列腺干細(xì)胞。同年汪泱等［27］和羅樹(shù)偉等［28］均成功分離培養(yǎng)了人胚腦神經(jīng)干細(xì)胞，并進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)和研究。

　　4 干細(xì)胞的應(yīng)用

胚胎干細(xì)胞是細(xì)胞的源頭,具有多能或全能性,并能夠無(wú)限分化,能夠制造機(jī)體需要的全部細(xì)胞,因此在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)上具有巨大潛力,應(yīng)用前景廣闊。但它存在著移植免疫排斥的限制和倫理學(xué)方面的困擾, 而成體干細(xì)胞只能在體外有限擴(kuò)增,多系分化效力低,通過(guò)體外的擴(kuò)增培養(yǎng)雖能夠提高轉(zhuǎn)化效率, 然而體外轉(zhuǎn)化是否會(huì)引起干細(xì)胞遺傳特性的改變尚不清楚。 但這類干細(xì)胞存在于宿主體內(nèi),可直接從患者自身獲得,故無(wú)移植免疫排斥的限制也無(wú)倫理學(xué)方面的困擾,因此胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞的研究對(duì)生命科學(xué)領(lǐng)域而言,都具有極重要的意義。

　　4.1 為發(fā)育生物學(xué)研究提供良好的體外模型系統(tǒng)哺乳動(dòng)物胚胎體積較小，而且在子宮內(nèi)進(jìn)行發(fā)育，因此很難在動(dòng)物體內(nèi)連續(xù)動(dòng)態(tài)地研究其早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞組織分化及基因表達(dá)調(diào)控， 而來(lái)源于胚胎的胚胎干細(xì)胞具有發(fā)育全能性、可操作性及無(wú)限擴(kuò)增的特性，因此胚胎干細(xì)胞提供了在細(xì)胞和分子水平上研究個(gè)體發(fā)育過(guò)程中極早期事件的良好材料和方法。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過(guò)比較胚胎干細(xì)胞不同發(fā)育階段的干細(xì)胞和分化細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，可確定胚胎發(fā)育及細(xì)胞分化的分子機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新基因。結(jié)合基因打靶技術(shù)，可發(fā)現(xiàn)不同基因在生命活動(dòng)中的功能等。

　　4.2 在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用理論上講，干細(xì)胞可以用于臨床細(xì)胞移植治療各種疾病和構(gòu)建人工組織或器官，其最適合的疾病主要是組織壞死性疾病如缺血引起的心肌壞死、腫瘤，退行性病變?nèi)缗两鹕�綜合征，自體免疫性疾病如胰島素依賴型糖尿病等。應(yīng)用干細(xì)胞治療疾病較傳統(tǒng)方法具有很多優(yōu)點(diǎn)：低毒性或無(wú)毒性，一次藥有效；不需要完全了解疾病發(fā)病的確切機(jī)理；不存在傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)：還可能應(yīng)用自身干細(xì)胞移植，避免產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。
　　
　　1999年Horwitz等［29］用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）治療遺傳性骨缺陷病，并取得了一定效果。2004年9月，意大利一名5歲、患有地中海貧血癥的男孩盧卡，科學(xué)家通過(guò)從其弟弟的胎盤(pán)血中提取干細(xì)胞移植到盧卡身上，使其戰(zhàn)勝病魔，完全治愈。

　　4.3 生產(chǎn)克隆動(dòng)物的高效材料胚胎干細(xì)胞是動(dòng)物克隆的優(yōu)良核供體。胚胎干細(xì)胞可以無(wú)限傳代和增殖而不失去其基因型和表現(xiàn)型,以其作為核供體進(jìn)行核移植后在短期內(nèi)可獲得大量基因型和表現(xiàn)型完全相同的個(gè)體。胚胎干細(xì)胞與胚胎嵌合生產(chǎn)克隆動(dòng)物可解決哺乳動(dòng)物遠(yuǎn)緣雜交的困難問(wèn)題。另外,由于體細(xì)胞克隆動(dòng)物存在成功率低、早衰、易缺陷易突變等問(wèn)題，且多是致命的,使胚胎干細(xì)胞的克隆研究仍十分重要。1999年Wakayaama等［30］用長(zhǎng)期傳代的小鼠胚胎干細(xì)胞克隆出31只小鼠，14只存活，存活率比體細(xì)胞克隆高。

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