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冠心病痰瘀證與載脂蛋白E基因多態(tài)性關(guān)系的研究
關(guān)載脂蛋白E(apolipoprotein E, ApoE)作為脂蛋白的組成部分和功能蛋白,對(duì)血脂代謝起調(diào)節(jié)作用, 編碼ApoE基因的變異是影響血漿膽固醇濃度的重要遺傳因素之一。已有報(bào)道證實(shí):不同遺傳背景人群的ApoE的基因多態(tài)性通過影響脂質(zhì)代謝而與冠心病(coronary heart disease, CHD)的發(fā)病密切相關(guān)[1~3]。證候是中醫(yī)認(rèn)識(shí)和治療疾病的根本,冠心病患者的臨床表現(xiàn)以血瘀證和痰瘀互阻證為多見[4]。本研究對(duì)冠心病不同證候的發(fā)生和ApoE基因多態(tài)性的相關(guān)性進(jìn)行了探討,現(xiàn)報(bào)道如下。
1 資料與方法
1.1 病例納入標(biāo)準(zhǔn) 選擇在北京西苑醫(yī)院和北京東方醫(yī)院就診的心肌梗死患者、或經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影及介入治療確診為冠心病的患者,這些患者均符合1999年美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)AHA/WHO公布的冠心病分型和診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。然后對(duì)這些患者進(jìn)行中醫(yī)辨證確定證候類型。痰證、血瘀證、痰瘀互阻證、氣虛證、陽虛證、陰虛證、氣滯證、寒凝證等參考國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布的《中醫(yī)臨床診療術(shù)語・證候部分》(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16751.21997)。
1.2 病例排除標(biāo)準(zhǔn) 半年內(nèi)曾有嚴(yán)重創(chuàng)傷或重大手術(shù)者;腎病綜合征,甲狀腺功能減退癥,急性肝膽疾病及糖尿病患者;服用藥物影響血脂代謝的患者;正在使用影響血脂代謝藥物的患者。
1.3 病例資料 按上述標(biāo)準(zhǔn)納入不同證候類型的冠心病患者共200例,其中男105例,女95例;平均年齡(63.6±5.8)歲;其中痰證20例(10%),瘀證79例(39.5%),痰瘀互阻證82例(41%),非痰非瘀證19例(9.5%);身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)為15.1~34.3 kg/m2。另選100名健康體檢者作為對(duì)照組,其中男55名,女45名;平均年齡(62.1±7.8)歲;均無冠心病癥狀,常規(guī)心電圖及超聲心動(dòng)圖檢查正常。以上樣本人群均來自北京和河北地區(qū),漢族,無血緣關(guān)系。所有病例均作標(biāo)準(zhǔn)基線問卷調(diào)查,結(jié)果記錄于按臨床流行病學(xué)要求設(shè)計(jì)的表格上。醫(yī)師、患者和實(shí)驗(yàn)研究人員之間實(shí)行盲法。
1.4 材料
1.4.1 主要試劑 血清總膽固醇(total cholesterol, TC)和總甘油三酯(total triglycerides, TG)測(cè)定試劑盒購自法國(guó)申能公司;高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein cholesterol, HDLC)和低密度脂蛋白膽固醇(lowdensity lipoprotein cholesterol, LDLC)測(cè)定試劑盒由日本第一化學(xué)藥品株式會(huì)社提供;血脂測(cè)定多項(xiàng)質(zhì)控物由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供;全血DNA純化試劑盒(Wizard genomic DNA purification kit)、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量Marker(PCR Marker和pBR322Hae Ⅲ Marker)以及限制性內(nèi)切酶HhaI均購自美國(guó)Promega公司;丙烯酰胺和NN’甲叉雙丙烯酰胺,均購自北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司。
1.4.2 血樣采集 患者空腹12 h后,靜脈抽取2 ml血樣,乙二胺四乙酸抗凝,用于提取DNA。
1.4.3 引物 根據(jù)Richard 等[6]設(shè)計(jì)引物,序列為P1:5’AACAACTGACCCCGGTGGCG 3’;P2:5’ ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC 3’,均由北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司合成。
1.5 方法
1.5.1 血脂水平的測(cè)定 測(cè)定TG采用膽固醇氧化酶過氧化物酶4氨基安替比林和酚法;測(cè)定TC采用脂蛋白脂肪酶甘油磷酸氧化酶過氧化物酶4氨基安替比林和酚法(GPOPAP酶法);測(cè)定HDLC采用選擇性抑制法;測(cè)定LDLC采用選擇性反應(yīng)法。致動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(atherogenic index, AI)的計(jì)算公式為:AI=(TC-HDLC)/HDLC。
1.5.2 ApoE基因型的測(cè)定 采用全血DNA純化試劑盒提取全血DNA。按《現(xiàn)代心臟內(nèi)科學(xué)》[5]中的條件擴(kuò)增ApoE基因的目的片段。反應(yīng)體系:10倍緩沖液2 μl,濃度為2 mmol/L的dNTPs 2 μl,二甲基亞砜2 μl,濃度為2 μmol/L的引物各0.25 μl,2 U Taq酶,DNA模板100~200 ng,總體積20 μl。循環(huán)條件:95 ℃預(yù)變性8 min,然后95 ℃ 45 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s,共35個(gè)循環(huán)后,72 ℃延伸8 min。經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)檢驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果。取10 μl PCR產(chǎn)物加入10倍酶切緩沖液2 μl,小牛血清0.2 μl,濃度為10 U/μl的HhaI 0.5μl,去離子水7.3 μl。37 ℃反應(yīng)4 h。產(chǎn)物用15% PAGE檢測(cè)其基因型。
1.5.3 樣品測(cè)序 隨機(jī)選取各基因型的PCR產(chǎn)物送北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有資料均采用SAS軟件包進(jìn)行分析。等位基因頻率計(jì)算采用頻率記數(shù)法;基因型,基因分布頻率及基因和證候的相關(guān)性分析用χ2檢驗(yàn)。不同基因型之間血脂的均數(shù)比較采用單因素方差分析。
2 結(jié)果
2.1 ApoE基因目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果 所有300例血樣均獲得了陽性擴(kuò)增條帶,目的片段分子量為292 bp。見圖1。
2.2 PCR產(chǎn)物HhaI酶切分型結(jié)果 在300例樣品中共檢測(cè)出6種ApoE基因型,分別為E 3/3、E 4/4、E 2/3、E 2/4、E 2/2、E 3/4型,等位基因分別為ε2、ε3和ε4。見圖2。圖3為E 4/4型的5’端正向測(cè)序結(jié)果掃描圖。將所有結(jié)果與GeneBank中已知的ApoE基因第4外顯子對(duì)應(yīng)部分序列進(jìn)行比對(duì),多態(tài)性位點(diǎn)堿基吻合,分型結(jié)果準(zhǔn)確。
2.3 ApoE基因型與等位基因頻率分布 CHD患者中ApoE 3/4基因型和ApoE ε4等位基因頻率明顯高于健康對(duì)照組(P<0.01, P<0.05),OR(Odds Ratio, 優(yōu)勢(shì)比也稱比值比)值為2.9924,采用MantelHaenszel方法算得95%的可信區(qū)間為[1.6508, 5.4242],使用CochranMantelHaenszel法得到P值為0.0002,表明ε4變異基因和CHD發(fā)病顯著相關(guān)。見表1。
2.4 ApoE基因多態(tài)性對(duì)血脂水平的影響 分析攜帶和不攜帶ε4等位基因患者的血脂水平,結(jié)果顯示攜帶ε4等位基因者TC、TG、LDLC和AI明顯升高(P<0.05或P<0.01);而HDLC降低,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明ε4等位基因具有“升高血脂”的作用,可加重動(dòng)脈粥樣硬化的程度和提高發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。見表2。
2.5 ApoE基因型與等位基因頻率在不同證候中的分布 E 3/4基因型和ε4等位基因頻率在痰證(syndrome of phlegm, PS)患者中明顯高于瘀證(syndrome of blood stasis, BSS)患者(P<0.05),而E 3/4基因型在非痰非瘀證患者(syndrome of nonphlegm and nonblood stasis, NPNBS)中的頻率則明顯高于瘀證和痰瘀互阻證(syndrome of phlegmblood stasis blocking, PBBS)患者(P<0.05),但未見其在ε4等位基因頻率間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表3。
圖1 ApoE基因第4外顯子目的片段PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖(略)
Fig 1 PCR amplification results of ApoE exon 4 target fragment
M: PCR marker; 1: PCR products; 2: PCR products
圖2 ApoE基因第4外顯子目的片段PCR產(chǎn)物的HhaI酶切分型結(jié)果電泳圖(略)
Fig 2 HhaI RFLP results of ApoE exon 4 PCR products
M: pBR322Hae Ⅲ marker; 1: Genotype E 3/3; 2: Genotype E 2/3;3: Genotype E 2/4; 4: Genotype E 2/2; 5: Genotype E 3/4;6: Genotype E 4/4
圖3 ApoE E 4/4基因型樣品的DNA測(cè)序圖譜(略)
Fig 3 Sequence mapping of genotype E 4/4 of ApoE
表1 ApoE基因型及等位基因頻率分布(略)
Tab 1 Frequency distribution of ApoE exon 4 genotypes and alleles in CHD group and control group
*P<0.05, **P<0.01, vs control group
表 2 ε4等位基因?qū)ρ降挠绊懀裕?/p>
Tab 2 Comparison of serum lipid level between patients in CHD group with and without ε4 allele
*P<0.05, **P<0.01, vs E 2/2+E 2/3+E 3/3 group
表3 各證候組ApoE第4外顯子基因型和等位基因頻率分布(略)
Tab 3 Frequency distribution of apoE exon 4 genotypes and alleles in CHD patients with different syndromes
*P<0.05, vs PBBS group; △P<0.05, vs BSS group
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