藥用植物代謝組學的研究進展
這是一篇藥用植物代謝組學的內(nèi)容，代謝組學正日益成為研究的熱點，越來越多的人已加入到代謝組學的研究中。隨著代謝組學積累的數(shù)據(jù)和信息量的增大，其在藥用植物學各個領(lǐng)域的應用價值也與日俱增。
【摘要】 從技術(shù)步驟、剖析辦法以及實踐使用三個方面對以后藥用動物代謝組學研討范疇的一些實際成績和理論中面臨的應戰(zhàn)停止綜述。
【關(guān)鍵詞】 藥用動物;代謝組學;功用基因組學
代謝組學是對生物體內(nèi)代謝物停止大規(guī)模剖析的一項技術(shù)[1]，它是零碎生物學的重要組成局部(如圖1所示)，藥用動物代謝組學次要研討外界要素變化對動物所形成的影響，如氣候變化、養(yǎng)分脅迫、生物脅迫，以及基因的漸變和重組等惹起的巨大變化，是物種表型剖析最強無力的工具之一。在古代中藥研討中，代謝組學在藥物無效性和平安性、中藥資源和質(zhì)量控制研討等方面具有重要實際意義和使用價值。另外，在對形式動物漸變體文庫或轉(zhuǎn)基因文庫停止剖析之前，代謝組學往往是首先思索采用的研討辦法之一。目前，國外已有成功應用代謝組學技術(shù)對擬南芥漸變株停止大規(guī)�；蛱暨x的例子，這爲與重要性狀相關(guān)基因功用的說明和選育可供商業(yè)化應用的轉(zhuǎn)基因作物奠定了根底。
目前，還有許多經(jīng)濟作物的全基因組測序方案尚未完成，由于代謝組學研討并不要求對基因組信息的理解，所以在與這些作物有關(guān)的研討范疇具有更大的應用價值，這也是其與轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學研討相比的劣勢之一。代謝組學研討觸及與生物技術(shù)、剖析化學、無機化學、化學計量學和信息學相關(guān)的少量知識，F(xiàn)iehn[2]對代謝組學有關(guān)的研討方向停止了分類(見表1)。
一、代謝組學研討的技術(shù)步驟
代謝組學研討觸及的技術(shù)步驟次要包括動物栽培、樣本制備、衍生化、別離純化和數(shù)據(jù)剖析5個方面(見圖2)。
1.1動物栽培
對研討對象停止培育的目的是爲了對樣本的波動性停止控制，絕對于微生物和植物而言，動物的人工栽培需求考
慮更多的成績，如中藥材在不同年齡、不同發(fā)育階段、不同部位以及光照、水肥、耕作等環(huán)境要素的巨大差別都可惹起生理形態(tài)的變化，而這些非可控及可控雙重要素的影響很難停止準確的控制，從而影響藥用動物代謝組研討的反復性。爲理解決以上成績，引薦運用大容量的培育箱[3]，定時改換培育箱中栽培對象的地位，以及運用無土栽培技術(shù)等，F(xiàn)ukusaki E[4]應用無土栽培零碎將水和營養(yǎng)間接引入動物根部，并且對供應量停止準確地控制，大大進步了實驗的反復性。
1.2樣本制備
爲了取得波動的實驗后果，樣本制備需求思索樣本的'生長、取樣的工夫和地點、取樣量以及樣本的處置辦法等成績，并依據(jù)剖析對象的分子構(gòu)造、溶解性、極性等理化性質(zhì)及其絕對含量大小對提取和別離的辦法停止選擇，逐一優(yōu)化實驗方案。Maharjan RP等[5]用6種辦法辨別對大腸桿菌中代謝產(chǎn)物停止提取，發(fā)現(xiàn)用-40℃甲醇停止提取的效果最好�，F(xiàn)階段代謝組學的剖析對象次要集中在親水性小分子，尤其是初級代謝產(chǎn)物，氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用(GC?MS)和毛細管電泳?質(zhì)譜(CE?MS)聯(lián)用都是剖析親水小分子的重要技術(shù)。Fiehn O等[6]運用GC?MS對擬南芥葉片中的親水小分子停止了剖析，發(fā)現(xiàn)酒石酸半縮醛、檸蘋酸、別蘇氨酸、羥基乙酸等15種動物代謝物。
1.3衍生化處置
對目的代謝產(chǎn)物的衍生化處置取決于所運用的剖析設備，GC?MS零碎只合適對揮發(fā)性成分停止剖析，高效液相色譜法(HPLC)普通則運用紫外或熒光標志的辦法對樣本停止衍生處置，Blau K[7]對酯化、�；�、烷基化、硅烷化、硼烷化、環(huán)化和離子化等衍生辦法停止了詳細的闡明。但是離子化抑制常使得質(zhì)譜剖析進程中目的代謝產(chǎn)物的離子化效率降低，這次要是由于別離進程中凈化物與目的代謝物難以完全別離開所惹起的，優(yōu)化色譜別離工夫可無效緩解離子化抑制，但是在實踐操作中不能夠?qū)ι习俜N代謝產(chǎn)物的別離工夫停止優(yōu)化，應用非放射性同位素濃縮法停止絕對定量可以很好的處理該成績。Han DK等[8]使用同位素編碼的親和標志(ICAT)，依據(jù)經(jīng)誘導分化的微粒蛋白及其同位素標志物的峰面積比，對該蛋白的絕對含量停止剖析。Zhang R等[9]發(fā)現(xiàn)同位素標志技術(shù)也可用于代謝組學的研討，但是卻存在許多困難�；铙w的同位素標志辦法關(guān)于同位素的洗脫是一種十分有潛力的技術(shù)，目前關(guān)于運用34 s的研討已有報道[10]。
1.4別離和定量
別離是代謝組學研討中的重要步驟，與質(zhì)譜聯(lián)用的色譜和電泳剖析技術(shù)都是運用紫外或電化學檢測的辦法停止定量，其對代謝組數(shù)據(jù)的分辨率與定量才能都有一定的影響。Tomita M等[11]總結(jié)了各種色譜別離法中常常遇到的技術(shù)成績，以為毛細管電泳和氣相色譜法由于具有較高的分辨率，已成爲代謝組學研討的慣例技術(shù)手腕之一，液相色譜因其適用范圍廣，使用也相當普遍。
Tanaka N等[12]用高效液相色譜對樣品停止別離，以為運用硅膠基質(zhì)填充毛細管全體柱的高效液相色譜零碎具有用量少、靈敏性高、高壓降高速別離等劣勢;同時，Tolstikov V等[13]也運用硅膠填充的毛細管液相色譜辦法對聚戊烯醇類異構(gòu)體停止了無效別離，取得了很好的分辨率。Tanaka N等[14]發(fā)現(xiàn)二維毛細管液相色譜法的分辨率比傳統(tǒng)的高效液相法高10倍。絕對于其他色譜辦法而言，超臨界流體色譜(SFC)是別離疏水代謝物最具潛力的技術(shù)之一，特別適用于別離那些傳統(tǒng)HPLC難以剖析的疏水聚合物，Bamba T等[15]經(jīng)過SFC對聚戊烯醇停止剖析，證明其具有較好的別離才能。針對質(zhì)譜中存在的共洗脫景象，Halket JM等[16]創(chuàng)造了一種適用于GC?MS的反褶積零碎，對共洗脫的代謝產(chǎn)物停止別離與辨認。Aharoni A等[17]運用傅立葉變換離子盤旋共振質(zhì)譜(FT?ICR?MS)對非目的代謝物停止剖析，疾速掃描動物漸變樣品，取得了一定量的代謝成分。
與別離一樣，定量才能也是代謝組學研討中的重要要素，其取決于各剖析零碎的線性范圍。傅立葉轉(zhuǎn)換核磁共振(FT?NMR)、傅立葉紅外光譜(FT?IR)以及近場紅外光譜法(NIR)等技術(shù)由于敏理性低，反復性受共洗脫景象影響較小也被用于檢測中。近年來，F(xiàn)T?NMR技術(shù)常被用于動物代謝組的指紋圖譜研討 [18]，但由于NMR剖析需求樣品量較大，剖析后果易受凈化，Griffin J L [19]發(fā)現(xiàn)將統(tǒng)計形式辨認與FT?NMR相結(jié)合可以對代謝物停止片面剖析。除FT?NMR之外，F(xiàn)T?IR經(jīng)過對無機成分的構(gòu)造停止慣例光譜測定，也可適用于代謝組學的研討，特別是使用于構(gòu)建代謝組學的指紋圖譜。雖然它不能對代謝物停止片面剖析，但對具有特定功用的組分卻有很好的定量效果，對從工業(yè)及食品原資料中別離的代謝混合物也可以停止片面剖析，目前，已有學者將其成功地使用于擬南芥[20]和番茄[21]代謝產(chǎn)物指紋圖譜的研討中。
1.5數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換
爲說明代謝物復雜的線性或非線性關(guān)系，需求停止多變量剖析，將原始的色譜圖數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換爲數(shù)字化的矩陣數(shù)據(jù)，經(jīng)過對色譜峰鑒定和整合從而停止多變量剖析。由于環(huán)境等要素的攪擾，光譜數(shù)據(jù)需求經(jīng)過適當?shù)臄?shù)據(jù)加工辦法停止校正，包括：①降低噪聲;②校正基線;③進步分辨率;④數(shù)據(jù)規(guī)范化。Jonsson P等 [22]報道了一種關(guān)于GC?MS色譜圖數(shù)據(jù)處置的辦法，可以對少量代謝產(chǎn)物樣品停止無效的辨認。
二、代謝組學中的數(shù)據(jù)剖析辦法
2.1主成分剖析法(PCA)
主成分剖析法，將實測的多個目標用多數(shù)幾個潛在的互相獨立的主成分目標線性組合來表示，反映原始測量目標的次要信息。使得剖析與評價目標變量時可以找出主導要素，切斷其他相關(guān)要素的攪擾，作出更爲精確的估量與評價。PCA數(shù)據(jù)矩陣通常來自于GC?MS，LC?MS 或CE?MS，因而將目的代謝產(chǎn)物作爲自變量，而相應的代謝產(chǎn)物含量作爲因變量，定義與最大特征值方向分歧的特征向量爲第一主成分，依此類推，PCA便能經(jīng)過對幾個次要成分的剖析，從代謝組中辨認出無效信息。主成分剖析有助于簡化剖析和多維數(shù)據(jù)的可視化，但是該辦法能夠招致一局部有用信息的喪失。
2.2層次聚類剖析法(HCA)
層次聚類剖析法也常用于代謝組學的研討中，它是將n個樣品分類，計算兩兩之間的間隔，構(gòu)成間隔矩陣，兼并間隔最近的兩類爲一新類，計算新類與以后各類的間隔。再兼并、計算，直至只要一類爲止。停止層次聚類前首先要計算類似度(similarity)，然后運用最短間隔法(Nearest Neighbor)、最長間隔法(Furthest Neighbor)、類間均勻鏈鎖法(Between?groups Linkage)或類內(nèi)均勻鏈鎖法(Within?groups Linkage)四種辦法計算類與類之間的間隔。該辦法雖然準確，但計算機數(shù)據(jù)密集，對少量數(shù)據(jù)點停止剖析時，更合適選用K?均值聚類法(KMC)或批次自組織映射圖法(BL?SOM)，而HCA合適將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換爲主成分后運用。
2.3自組織映射圖法(SOM)
神經(jīng)網(wǎng)絡中臨近的各個神經(jīng)元經(jīng)過側(cè)向交互作用互相競爭，開展成檢測不同信號的特殊檢測器，這就是自組織特征映射的含義。其根本原理是將多維數(shù)據(jù)輸出爲幾何學節(jié)點，類似的數(shù)據(jù)形式聚成節(jié)點，相隔較近的節(jié)點組成相鄰的類，從而使多維的數(shù)據(jù)形式聚成二維節(jié)點的自組織映射圖。除PCA和HCA外，SOM異樣也可使用于包括基因組和轉(zhuǎn)錄組等組學研討中 [23]。最后SOM計算工夫長，依托數(shù)據(jù)輸出順序決議聚類后果，近年來SOM逐步開展成爲不受數(shù)據(jù)錄入順序影響的批次自組織映射圖法(BL?SOM)。由于BL?SOM可以對類停止調(diào)整，且有明白的分類規(guī)范，優(yōu)化次第優(yōu)于其他聚類法，已在基因組學和轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)剖析中失掉普遍的使用。
2.4其他數(shù)據(jù)采礦辦法
除PCA、HCA和SOM外，很多變量剖析辦法都可用于動物代謝組學的剖析。軟獨立建模分類法(SIMCA)是應用主成分模型對未知樣品停止分類和預測，合適對少量樣本停止剖析;近鄰分類法(KNN)和K均勻值聚類剖析法(KMN)也可用于樣品分類;主成分回歸法(PCR)或偏最小二乘回歸法(PLS)在某些狀況下也可運用。但是到目前爲止由于還沒有樹立一個規(guī)范的數(shù)據(jù)剖析辦法，代謝組學依然是一門有待完善的學科。
三、代謝組學在藥用動物中的理論
動物藥材來源于藥用動物體，而藥用動物體的形狀建成是其體內(nèi)一系列生理、生化代謝活動的后果。動物代謝活動分爲初生代謝和次生代謝，初生代謝在動物生命進程中一直都在發(fā)作，其經(jīng)過光協(xié)作用、檸檬酸循環(huán)等途徑，爲次生代謝的發(fā)作提供能量和一些小分子化合物原料。次生代謝往往發(fā)作在動物生命進程中的某一階段，其次要生物分解途徑有莽草酸途徑、多酮途徑和甲瓦龍酸途徑等。動物藥材含有的生物堿、胺類、萜類、黃酮類、醌類、皂苷、強心苷等活性物質(zhì)的絕大少數(shù)屬于次生代謝產(chǎn)物，因而討論次生代謝產(chǎn)物在藥用動物體內(nèi)的分解積聚機制及其影響要素，關(guān)于進步活性物質(zhì)含量、保證藥材質(zhì)量、波動臨床療效等具有重要意義。孫視等[24]經(jīng)過對銀杏葉中黃酮類成分積聚規(guī)律的研討，提出了選擇具有一定環(huán)境壓力的次適合生態(tài)環(huán)境處理藥用動物栽培中生長和次消費物積聚的矛盾。王昆等[25]以人參葉組織爲資料,總結(jié)了構(gòu)建人參葉cDNA文庫進程中存在的一些關(guān)鍵成績和應采取的對策,爲今后關(guān)于人參無效成分如人參皂苷的生物分解途徑及其調(diào)控的根底研討提供技術(shù)參考和實際指點。最近，美國加利福尼亞大學伯克利分校的Keasling等[26]采用一系列的轉(zhuǎn)基因調(diào)控辦法，經(jīng)過基因工程酵母分解了青蒿素的前體物質(zhì)——青蒿酸，其產(chǎn)量超越100 mg/L，爲無效降低抗瘧藥物的本錢提供了機遇。經(jīng)過臨時的研討積聚，人們對代謝途徑的主干局部(爲次生代謝提供底物的初生代謝途徑)曾經(jīng)根本理解，例如酚類的莽草酸途徑， 萜類的異戊二烯二磷酸(IPP)途徑等。被子動物中一些絕對激進的次生代謝途徑也失掉了很好的研討，如黃酮類、木質(zhì)素的生物分解與調(diào)控。但是，對次生代謝最豐厚最神奇的局部——特定產(chǎn)物分解與積聚的進程，還所知甚少[27]。
四、展 望
近年來，代謝組學正日益成爲研討的熱點，越來越多的人已參加到代謝組學的研討中。隨著代謝組學積聚的數(shù)據(jù)和信息量的增大，其在藥用動物學各個范疇的使用價值也日積月累。它將不只能對單個代謝物停止全方面的剖析，更能尋覓其代謝進程中的關(guān)鍵基因、經(jīng)過代謝指紋剖析對藥用動物停止疾速分類、進一步研討藥用動物無效成分代謝途徑以及環(huán)境因子對動物代謝和質(zhì)量的影響與調(diào)控機制。
但是根據(jù)傳統(tǒng)西醫(yī)藥學和零碎生物學的指點思想，目前急待處理的是中藥種質(zhì)資源的代謝組學研討和中藥體內(nèi)作用的代謝組學研討。同時，代謝組學在剖析平臺技術(shù)、辦法學手腕和使用戰(zhàn)略等方面絕對于其他組學技術(shù)還需求進一步開展和完善，還需求其他學科的配合和介入。置信隨著更無力的成分剖析設備的運用及代謝組數(shù)據(jù)庫的樹立，藥用動物代謝組學將對西醫(yī)藥學發(fā)生深遠的影響。
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