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高效液相色譜法測(cè)定羅布麻茶中槲皮素的含量
Abstract：Objective To determine the content of quercetin in the Luobuma Tea by HPLC. Method The mobile phase consisted of methanol-0.4% phosphoric acid (50∶50). Kromasil C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used. The wavelength for measurement was at 371 nm and the temperature was at 30 ℃. Result The calibration curve was linear in the range of 5.98～47.84 g/mL for quercetin. The regression equation was A=7 750.68C+1 196.33 (r=0.999 7). Conclusion This method can be used to determine the content of quercetin in Luobuma Tea accurately.
Key words：Luobuma Tea;quercetin;HPLC;content determination
羅布麻茶為羅布麻Apocynum venetum L.的葉經(jīng)烘干粉碎制成的單方制劑,具有平肝安神、清熱利水作用。臨床用于肝陽(yáng)眩暈、心悸失眠、浮腫尿少,高血壓病,神經(jīng)衰弱,腎炎浮腫。現(xiàn)已被《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(中藥成方制劑)》收載,該標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定以蘆丁為對(duì)照品,采用分光光度法測(cè)定。鑒于該含量測(cè)定方法操作比較繁瑣、重現(xiàn)性差,因此選擇蘆丁水解苷元槲皮素作為羅布麻茶含量測(cè)定的控制成分。本試驗(yàn)報(bào)道高效液相色譜法測(cè)定羅布麻茶中槲皮素含量的方法學(xué)研究,結(jié)果表明,該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,可以控制羅布麻的質(zhì)量[1]。
1、儀器與試劑
島津LC-10ADvp高效液相色譜儀,SPD-10Avp紫外檢測(cè)器,HT-230A柱溫箱;Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);島津UV-2401紫外分光光度計(jì);Sartorius BP211D電子天平(準(zhǔn)確到0.01 mg)。槲皮素對(duì)照品(批號(hào)100081-200406,購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所)。甲醇為色譜純,水為重蒸水,其余試劑均為分析純。羅布麻茶樣品(山東省百草藥業(yè)有限公司提供)。
2、方法與結(jié)果
2.1 色譜條件
以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為371 nm;柱溫30 ℃。理論塔板數(shù)按槲皮素峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000[2-3]。見(jiàn)圖1。
2.2 對(duì)照品溶液的制備
精密稱取槲皮素對(duì)照品6.15 mg,置于100 mL量瓶中,加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻,得對(duì)照品溶液(59.84 g/mL)。
2.3 供試品溶液的制備
取本品內(nèi)容物(過(guò)3號(hào)篩)約0.5 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,加甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)20 mL,加熱回流1 h,取出,放冷,濾過(guò),將濾液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中,加甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)稀釋至刻度,搖勻,即得。
2.4 線性關(guān)系考察
分別精密吸取對(duì)照品溶液1、2、4、6、8 mL,置于10 mL量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,得對(duì)照品溶液1、2、3、4、5(濃度分別為5.98、11.97、23.94、35.90、47.84 g/mL)。每份溶液進(jìn)2針,記錄峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo),對(duì)照品濃度(g/mL)為橫坐標(biāo),計(jì)算回歸方程。得回歸方程：A=7 750.68C+1 196.33 (r=0.999 7),線性范圍為5.98～47.84 g/mL。
2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取重復(fù)性試驗(yàn)中批號(hào)06040101的供試品溶液為穩(wěn)定性試驗(yàn)考察對(duì)象,分別在0、1、2、4、6 h進(jìn)行,平均峰面積RSD=0.86%,結(jié)果表明供試品在8 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定。
2.6 精密度試驗(yàn)
取批號(hào)為06040101的供試品溶液6份,按上述色譜條件測(cè)定峰面積,連續(xù)測(cè)定6次。平均峰面積為305797,RSD=0.85%(n=6)。
2.7 加樣回收率試驗(yàn)
取批號(hào)為06040101的樣品9份,每份0.25 g,精密稱定,置于圓底燒瓶中,分別加入對(duì)照品適量,按“供試品溶液的制備”方法配制9份供試品溶液,每份溶液進(jìn)2針,采用標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照法依法測(cè)定,計(jì)算,結(jié)果平均加樣回收率為98.25%,RSD=2.64%。表明本方法回收率良好(見(jiàn)表1)。表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果(略)表2 羅布麻茶樣品含量測(cè)定結(jié)果(略)
2.8 樣品測(cè)定結(jié)果
3、討論
槲皮素溶于甲醇、乙醇,微溶于水。本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取溶劑和水解條件,結(jié)果表明,選擇甲醇-25%鹽酸(4∶1)溶液為提取溶劑,直接回流水解60 min,對(duì)羅布麻茶中槲皮素提取效果好。對(duì)槲皮素甲醇溶液于200～400 nm波長(zhǎng)下掃描,結(jié)果最大吸收波長(zhǎng)為371 nm,因此,選用371 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng),結(jié)果供試液中槲皮素與其它組分色譜峰得到較好的分離,靈敏度高和雜質(zhì)干擾小,且空白試驗(yàn)無(wú)干擾,溶劑無(wú)干擾。本試驗(yàn)所用方法和色譜條件可作為羅布麻茶質(zhì)量控制的含量測(cè)定方法。
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