簡(jiǎn)析清肺抑火片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究
【摘要】：目的 建立清肺抑火片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法 采用薄層色譜法對(duì)清肺抑火片處方中苦參、黃柏、前胡進(jìn)行了定性鑒別;采用高效液相色譜法測(cè)定處方中黃芩苷的含量。采用ODS色譜柱;流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2);流速：1 mL/min;柱溫25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm。結(jié)果 本品定性鑒別薄層色譜特征明顯，專(zhuān)屬性強(qiáng);黃芩苷的線(xiàn)性范圍為0.163～0.975 μg，r=0.999 9，平均回收率97.43%，RSD=1.97%(n=6)。結(jié)論 該方法重現(xiàn)性好，簡(jiǎn)單，可有效控制清肺抑火片的質(zhì)量。
【關(guān)鍵詞】清肺抑火片 苦參 前胡 黃柏 黃芩苷 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
Abstract：Objective To establilsh the quality standard for Qingfei Yihuo tablet. Methods TLC was performed to identify Sophora flavescens Ait， Peucedani and Cortex Phellodendri. HPLC was used to determine Baicalin. ODS column was used. The mobile phase consisted of methanol-water-phosphoric acid (47∶53∶0.2). The flow rate was 1.0 mL/min and column temperature was at 25 ℃. The detecting wave length was at 280 nm. Results The characteristic for identification by TLC was distinct and hightly specific. Baicalin could be determined by HPLC. The linearity of Baicalin was good in the range of 0.163～0.975 μg (r=0.999 9). The average recovery of Baicalin was 97.43% and RSD was 1.97% (n=6). Conclusion The methods of identification and quantification is simple and reproducible. It can be used effectively for the quality control of Qingfei Yihuo table.
Key words：Qingfei Yihuo tablet;Sophora flavescens Ait;Peucedani;Cortex Phellodendri;Baicalin;quality standard
清肺抑火片由黃芩、梔子等9味中藥組成，收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》第二冊(cè)(WS3-B-0418-90)[1]。具有清肺止嗽、降火生津的作用，用于肺熱咳嗽、痰延壅盛、咽喉腫痛、口鼻生瘡、牙齒疼痛、牙齦出血、大便干燥、小便赤黃。原部頒標(biāo)準(zhǔn)無(wú)鑒別和含量測(cè)定項(xiàng)，不能全面反映制劑的質(zhì)控要求。已報(bào)道的有對(duì)方中黃芩、梔子、大黃的薄層鑒別[2]，本試驗(yàn)對(duì)處方中其余藥味中的苦參、黃柏、前胡進(jìn)行了薄層鑒別研究，以更全面反映該制劑的質(zhì)量。清肺抑火片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究該制劑主要藥味為黃芩，黃芩苷是其主要有效成分，對(duì)黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定，可以進(jìn)一步完善和提高清肺抑火片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
1、儀器與試藥
Agilent 1100高效液相色譜儀，Agilent 1100化學(xué)工作站，DAD二級(jí)管陣列檢測(cè)器;ODS C18色譜柱(10 μm，250 mm×4.6 mm);定量毛細(xì)管(U.S.A.Drummond);939型薄層制板器(重慶南岸貝爾德儀器技術(shù)廠);CX-150型超聲波清洗機(jī)(北京天海雙龍醫(yī)療設(shè)備有限公司)。
鹽酸小檗堿(批號(hào)713-9906)、苦參堿(批號(hào)0805- 200005)、黃芩苷對(duì)照品(批號(hào)110715-200212)，及苦參(批號(hào)121019-200304)、黃柏(批號(hào)120937-200305)和前胡(白花前胡)對(duì)照藥材(批號(hào)120951-200003)均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定所;清肺抑火片(山西振東制藥公司，批號(hào)20070401、20070402、20070403)。硅膠G、GF254(青島海洋化工有限公司);甲醇為色譜純;水為蒸餾水;磷酸為分析純。
2、薄層色譜鑒別
2.1 苦參
取清肺抑火片5片，研細(xì)，加濃氨試液3 mL、三氯甲烷50 mL，放置過(guò)夜，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。另取苦參對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取苦參堿對(duì)照品，加乙醇制成每1 mL含0.2 mg的'溶液，作為對(duì)照品溶液。再按處方比例和制備方法制備缺苦參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)[3]，吸取上述供試品溶液2 μL，對(duì)照藥材溶液10 μL，對(duì)照品溶液8 μL，陰性對(duì)照溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一用2%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以苯-丙酮-甲醇(8∶3∶0.5)為展開(kāi)劑，進(jìn)行第1次展開(kāi)，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶4∶2∶1)10 ℃以下放置的上層溶液進(jìn)行第2次展開(kāi)，兩次展距均為8 cm，以稀碘化鉍鉀為顯色劑。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的橙色斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。
2.2 黃柏
取清肺抑火片1片，研細(xì)，加甲醇10 mL，加熱回流30 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取黃柏對(duì)照藥材50 mg，加甲醇5 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。再按處方比例和制備方法制備缺苦參的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(10∶6∶1∶1)為展開(kāi)劑，置氨蒸氣預(yù)飽和的展開(kāi)缸內(nèi)，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。
2.3 前胡
取清肺抑火片10片，研細(xì)，加三氯甲烷40 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取前胡對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再按處方比例和制備方法制備缺前胡的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成缺前胡的陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯(19∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾。
3、含量測(cè)定
3.1 色譜條件
色譜柱：ODS C18(10 μm，250 mm×4.6 mm);流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2);檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm;流速：1 mL/min;柱溫25 ℃;理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算不得低于2 500。
3.2 溶液的制備
對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取在60 ℃減壓干燥4 h的黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含黃芩苷60 μg的溶液，即得。
供試品溶液的制備：取本品10片，除去薄膜衣，研細(xì)，取細(xì)粉約0.5 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100 mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
陰性對(duì)照溶液的制備：取除黃芩以外的其余藥味，按制備工藝制備不含黃芩的樣品，按供試品溶液制備方法制成不含黃芩的陰性對(duì)照溶液。
3.3 測(cè)定法
分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。
3.4 線(xiàn)性關(guān)系的考察
制備濃度為65 μg/mL的黃芩苷甲醇溶液，微孔濾膜濾過(guò)，依次進(jìn)樣2.5、5、7.5、10、15、20 μL，對(duì)所得峰面積和各對(duì)照品進(jìn)樣量作回歸處理，得黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并計(jì)算得黃芩苷回歸方程：Y=2 734.336 24X-4.427 33，r=0.999 9。結(jié)果表明，黃芩苷的量在0.163～0.975 μg線(xiàn)性范圍良好。
3.5 精密度試驗(yàn)
取同一批號(hào)樣品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL。結(jié)果供試品中，黃芩苷峰面積積分值RSD=0.8%(n=6)，表明儀器精密度良好。
3.6 重現(xiàn)性試驗(yàn)
取同一批樣品(批號(hào)20070401)，分別按供試品溶液制備方法制備5份樣品，照上述色譜條件測(cè)定，測(cè)得黃芩苷的平均含量19.48 mg/g，RSD=1.35%(n=5)。
3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)
取同一批號(hào)樣品溶液，每隔2 h進(jìn)樣1次，每次10 μL，進(jìn)樣6次，結(jié)果6次含量RSD=2.27%，表明樣品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。
3.8 回收率試驗(yàn)
取已知含量的清肺抑火片樣品(批號(hào)20070401)6份，分別添加黃芩苷對(duì)照品適量，按供試品溶液的制備方法制成供試溶液，依法測(cè)定，結(jié)果平均回收率97.43%，RSD=1.97%，見(jiàn)表1。表1 回收率測(cè)定結(jié)果(略)
3.9 樣品的含量測(cè)定
按上述方法測(cè)定3批樣品中黃芩苷的含量，每份平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表2。表2 樣品的含量測(cè)定結(jié)果(略)
3.10 陰性干擾試驗(yàn)
取陰性對(duì)照品溶液，按黃芩苷含量測(cè)定項(xiàng)下的方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果供試品色譜圖中，在與黃芩苷對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上，沒(méi)有色譜峰出現(xiàn)，表明處方中其它藥味對(duì)其測(cè)定無(wú)干擾[4]。結(jié)果見(jiàn)圖1。
4、討論
方中黃柏、前胡的薄層色譜具有熒光特性，無(wú)須噴顯色劑， 3，5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定可以快速進(jìn)行定性鑒別。鑒別前胡時(shí)，溶劑系統(tǒng)的極性需要適當(dāng)調(diào)整，方能顯出熒光斑點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程試用了3∶1、3∶2、1∶1的石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯[3，5]系統(tǒng)，結(jié)果斑點(diǎn)重疊;改用三氯甲烷-乙酸乙酯系統(tǒng)時(shí)，供試品斑點(diǎn)能明顯分開(kāi)，此系統(tǒng)調(diào)節(jié)比例為19∶1時(shí)，展距適中，斑點(diǎn)清晰，達(dá)到較好的分離。對(duì)黃柏的鑒別應(yīng)預(yù)先飽和，否則邊緣效應(yīng)嚴(yán)重，應(yīng)先飽和10～20 min，再展開(kāi)。苦參鑒別應(yīng)注意顯色劑及展距，展距為8 cm，分離度適中，顯色劑為稀碘化鉍鉀時(shí)，色譜斑點(diǎn)清晰;若顯色劑為碘化鉍鉀，則背景重，色譜斑點(diǎn)效果一般。
黃芩苷是黃芩的主要有效成分，上述含量測(cè)定條件為2005版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)黃芩項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，復(fù)方制劑在此條件下，黃芩苷與其它峰能夠很好的分開(kāi)，無(wú)需調(diào)整流動(dòng)相的極性，便可進(jìn)行定量研究。本方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，可用于該制劑的質(zhì)量控制，進(jìn)一步完善了該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
【參考文獻(xiàn)】
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