- 相關(guān)推薦
高效液相色譜法測定人血漿中全反式維甲酸血藥濃度
【關(guān)鍵詞】 血藥濃度
摘要:目的 建立高效液相色譜法測定人血漿中全反式維甲酸濃度。方法 色譜柱為Supelcosil LC18DB柱(5 μm,4.6 mm×250 mm);流動相為甲醇水冰乙酸(體積比82∶17∶1);柱溫為室溫;流速1.5 mL・min-1;檢測波長為340 nm。結(jié)果 全反式維甲酸血藥質(zhì)量濃度在10～1000 ng・mL-1范圍內(nèi)，與峰面積比有良好的線性關(guān)系(r=0.9997)，最低檢測濃度為2.5 ng・mL-1。平均方法回收率為(94.5±4.7)%(n=15)。日內(nèi)RSD≤4.1%，日間RSD≤6.2%。結(jié)論 本方法簡單、快速、靈敏、重現(xiàn)性好，適用于全反式維甲酸臨床血藥濃度監(jiān)測及人體藥代動力學研究。
關(guān)鍵詞:全反式維甲酸;血藥濃度;高效液相色譜法
Abstract: Objective To establish a HPLC method for determination of alltrans retinoic acid in human plasma. Methods A Supelcosil LC18DB column (5 μm,4.6 mm×250 mm) was adopted. Mobile phase was a mixture of methanol,water and glacial acetic acid(82∶17∶1). The flow rate was 1.5 mL・min-1. The UV detection wave was 340 nm. ResultsThe assay procedure was shown to produce linear calibration curves over the range of 10 ng・mL-1 to 1000 ng・mL-1 of alltrans retinoic acid in plasma (r=0.9997). Within the range,the recovery rate was (94.5±4.7)%,and the intraday RSD and interday was less than 4.1% and 6.2%,respectively. The detection limit of all trans retinoic acid was 2.5 ng・mL-1. Conclusions This method is repeatable,convenient and sensitive for plasma concentration monitoring and clinical pharmacokinetics study of alltrans retinoic acid.
Key words:alltrans retinoic acid; plasma concentration; HPLC
全反式維甲酸(alltrans retinoic acid,ATRA) 是維生素A 的天然氧化代謝產(chǎn)物，可抑制白血病細胞的增殖，誘導白血病細胞分化成熟，是目前治療急性早幼粒細胞白血病(APL)的有效藥物。ATRA對APL初發(fā)患者完全緩解率可達85%以上，但對復(fù)發(fā)患者再次應(yīng)用ATRA則效果不佳，其原因可能是ATRA對參與其代謝的酶活性具有自身誘導作用，持續(xù)用藥導致血藥濃度逐步降低[1]。本文參考文獻[2-4]，建立了一種靈敏、準確的ATRA血藥濃度HPLC測定法，旨在為全反式維甲酸臨床血藥濃度監(jiān)測及人體藥代動力學研究提供測定方法。
1 材料與方法
1.1 儀器
Waters高效液相色譜儀(515型恒流泵，486型紫外檢測器，Millennium32色譜工作站);XW―80A旋渦混合器(上海醫(yī)科大學儀器廠);3K18高速冷凍離心機(Sigma);高速離心機(美國雅培公司TDx儀附件)。
1.2 藥品與試劑
ATRA對照品(Sigma,純度：98%)，阿維A酸(內(nèi)標，羅氏公司)，甲醇為色譜純試劑，其余試劑均為分析純。
1.3 色譜條件
色譜柱為Supelcosil LC18DB柱(5 μm，4.6 mm×250 mm);柱溫為室溫。流動相：甲醇水冰乙酸(體積比82∶17∶1);流速1.5 mL・min-1。檢測波長340 nm。
1.4 血藥濃度測定法
1.4.1 ATRA對照溶液配制
精密稱取ATRA對照品適量，以甲醇溶解并定容，制得濃度為100 μg・mL-1的ATRA儲備液。將ATRA儲備液以甲醇稀釋，配制濃度分別為0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg・mL-1的ATRA對照溶液。
1.4.2 內(nèi)標液配制
取內(nèi)標阿維A酸適量，置于100 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，制得濃度為7.5 μg・mL-1的內(nèi)標液。
1.4.3 樣本處理
精密吸取血漿樣品1 mL，置10 mL具塞離心試管中，加入內(nèi)標溶液20 μL，旋渦混合30 s。加入1 mol・L-1的HCl溶液500 μL，漩渦混合30 s，再加入乙酸乙酯3 mL，旋渦混合1 min，4 500 r/min離心5 min。轉(zhuǎn)移上層液至尖底試管中，于37 ℃水浴中氮氣流吹干。殘渣加入流動相200 μL漩渦混合30 s使溶解，10 000 r/min離心5 min，取上清液50 μL進樣，記錄色譜圖，以ATRA峰面積(As)與內(nèi)標峰面積(Ai)之比代入標準曲線計算ATRA血藥濃度。
1.4.4 標準曲線
精密量取空白血漿1 mL，置10 mL具塞離心管中，分別加入不同濃度ATRA對照溶液20 μL，混勻，使血藥濃度分別為10、20、50、100、200、500、1000 ng・mL-1。按樣本處理方法操作，以不同濃度ATRA系列溶液的As和Ai來計算A(A=As/Ai)，以A值為縱坐標，ATRA質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標進行直線回歸。
1.4.5 回收率及精密度
分別于1 mL空白血漿中加入低、中、高3種濃度的ATRA對照溶液20μL，混勻，使其濃度分別為10、200、1000 ng・mL-1，按樣本處理方法操作，計算ATRA血藥濃度，以測得濃度與配制濃度之比計算方法回收率。另以甲醇配制相應(yīng)系列濃度的ATRA溶液，不經(jīng)提取直接測定，以此為標準，將兩組峰面積相比，計算ATRA萃取回收率。以1 d內(nèi)測得的ATRA濃度計算日內(nèi)精密度，以1周內(nèi)5次測定的ATRA濃度計算日間精密度。
2 結(jié) 果
2.1 色譜行為
在上述色譜條件下，ATRA與內(nèi)標物及血漿內(nèi)源性物質(zhì)能夠較好分離，ATRA與內(nèi)標的保留時間分別為8.8 min和6.7 min�？瞻籽獫{及血漿樣品色譜圖見圖1。
2.2 線性范圍
ATRA血藥質(zhì)量濃度(ρ)在10～1000 ng・mL-1范圍內(nèi)，與峰面積比(A)有良好線性關(guān)系，其回歸方程為：A=00116ρ+0.0036，r=0.9997。以信噪比S/N=3：1計，ATRA最低檢測濃度為2.5 ng・mL-1。
2.3 回收率及精密度
高、中、低3種濃度的提取回收率分別為(84.6±5.2)%、(81.2±6.3)%、(81.6±4.6)%，平均方法回收率為(94.5±4.7)%(n=15)。3種濃度的日內(nèi)RSD≤4.1%，日間RSD≤6.2%。結(jié)果見表1。表1 回收率及精密度(略)
3 討 論
本文建立了一種靈敏、準確的ATRA血藥濃度高效液相色譜測定法，適用于APL病人ATRA 血藥濃度的常規(guī)監(jiān)測及臨床藥代動力學研究。通過監(jiān)測ATRA血藥濃度，可以更好地了解在某些APL病人連續(xù)用藥治療中臨床復(fù)發(fā)及耐藥的原因。
ATRA化學性質(zhì)活潑，見光易異構(gòu)化或氧化降解，因此在樣品提取過程中應(yīng)特別注意避光操作。提取過程中血漿加入1 mol・L-1 HCl溶液，使血漿酸化，可提高萃取回收率，乙酸乙酯一步萃取可使萃取回收率達到80%以上。
由于ATRA中的羧基可以與色譜柱中的硅醇基等發(fā)生相互作用，導致色譜峰拖尾，在流動相中加入1%(ω)醋酸，可抑制這種作用，消除ATRA峰拖尾現(xiàn)象。
參考文獻:
[1]MUINDI J,FRANLCEL S R,MILLER W H,et al. Continuous treatment with all - trans retinoic acid causes a progressive reduction in plasma drug concentrations: implications for relapse and retinoid "resistance" in patients with acute promyelocytic leukemia[J]. Blood,1992,79: 299.
[2]余自成，姚帥，郁人海.高效液相色譜法同時檢測人血清中全反式及13-順式維甲酸濃度[J].藥物分析雜志，2000，20(4):226.
[3]MICHIKO M,HIROKAZU Y, HARUKO,et al. Simultaneous quantification of retinol,retinal,and retinoic acid isomers by highperformance liquid chromatography with a simple gradiation[J]. J Chromatogr B,2001，757: 365.
[4]CARSTEN K S,ABRAHAM B, HEINZ N. Chromatographic analysis of endogenous retinoids in tissues and serum[J]. Anal Biochem,2003,315:36.
【高效液相色譜法測定人血漿中全反式維甲酸血藥濃度】相關(guān)文章：
淺談高效液相色譜法測定人血漿中全反式維甲酸血藥濃度03-19
反相高效液相色譜法測定人血漿中單硝酸異山梨酯的濃度03-18
高效液相色譜法測定咽寶合劑中連翹苷的含量03-15
反相高效液相色譜法測定尿液4種腎病標志物03-02