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淺談硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體的釋放度和藥效學(xué)研究
【摘要】 目的 考察硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體的體外釋放度及其藥效。方法 采用pH梯度法制備硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體，用透析法測(cè)定其體外釋放度和血漿釋放度，通過(guò)抗小鼠S180腫瘤的抑瘤率評(píng)價(jià)藥效。結(jié)果 硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體體外釋放度符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型;聚乙二醇單甲醚2000膽固醇琥珀酸酯修飾的硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體釋放度降低，抑瘤率顯著提高。結(jié)論 長(zhǎng)循環(huán)硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體降低藥物釋放度，提高藥效。
【關(guān)鍵詞】 硫酸長(zhǎng)春新堿 脂質(zhì)體 長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體 釋放度 藥效學(xué)
Abstract:Objective To investigate the release rate and pharmacodynamics in vitro of of vincristine sulfate liposomes. Methods Vincristine sulfate liposomes was prepared by pH gradient method. The release rate was measured by dialysis method. Pharmacodynamics of vincristine sulfate liposomes was evaluated by its antitumor efficacy. Results The release rate of vincristine sulfate liposomes in vitro was fitted to zero?order model. After modification with long?circulating adjuvant, the release rate of vincristine sulfate liposomes decreased and antitumor efficacy increased obviously. Conclusion Long?circulating vincristine sulfate liposomes decrease release rate and increase curative effect.
Key words:vincristine sulfate; liposome; long?circulating liposome; release rate; pharmacodynamics
硫酸長(zhǎng)春新堿(vincristine, VCR)為長(zhǎng)春花生物堿類抗腫瘤藥物，對(duì)白血?⒘馨土鼉哂邢災(zāi)?钚浴A俅燦τ玫牧蛩岢ご盒錄釵?⑸浼粒?嬖謐乓┪鋨胨テ詼獺⒋?豢�、神�?低澈臀賦Φ藍(lán)拘鄖康熱鋇恪S醒芯勘礱鰨??侍遄魑?怪琢鲆┪鐫靨蹇梢愿納埔┪錮砘?災(zāi)省⑻岣吡菩�、綑n拖低澈吞囟ú課唬ㄈ縲腦�、捎z┑畝靖弊饔茫?]。Peter MK等人的研究也表明，硫酸長(zhǎng)春新堿制成脂質(zhì)體能改善藥物體內(nèi)行為、提高療效、降低毒副作用[2]。因此，抗腫瘤藥物與脂質(zhì)體結(jié)合的處方設(shè)計(jì)越來(lái)越受到關(guān)注。
本文采用主動(dòng)載藥法中的pH梯度法，以氫化大豆卵磷脂/膽固醇(HSPC/Chol)為脂質(zhì)體膜制備硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體�？疾炝蛩衢L(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體的釋放度和抗小鼠S180腫瘤抑瘤率，同時(shí)考察長(zhǎng)循環(huán)輔料聚乙二醇單甲醚2000膽固醇琥珀酸酯(CHSPEG2000)對(duì)釋放度和抑瘤率的影響，以期為該藥臨床應(yīng)用提供更好的給藥劑型。
1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1 試藥
硫酸長(zhǎng)春新堿(廣州環(huán)葉制藥有限公司)，硫酸長(zhǎng)春新堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所)，氫化大豆卵磷脂(HSPC，德國(guó))，膽固醇(Chol，藥用，溫州市甌海食品生化廠)，CHSPEG2000 (聚乙二醇單甲醚2000膽固醇琥珀酸酯，自制)，陽(yáng)離子樹脂(上海樹脂廠)，其他試劑均為分析純。
1.2 儀器
P230高效液相色譜儀(大連依利特)，F(xiàn)C204分析天平(上海精科儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋(大連醫(yī)療器械廠)，PHS?25型pH計(jì)(上海精科雷磁)，DF?101磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)，透析袋(美國(guó)VIKASE公司)，M?110L型微射流儀(美國(guó)microfluids公司)。
1.3 動(dòng)物
小白鼠(18～22 g，沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK 遼2005-008);家兔(2～3 kg，沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK 遼2005—008);S180腫瘤(遼寧省腫瘤研究所)。
2 方法與結(jié)果
2.1 pH梯度法制備硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體及包封率測(cè)定[3]
2.1.1 HPLC條件
色譜柱：Kromasil C18(200 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相：甲醇?水?二乙胺(體積比70∶30∶0.5)(磷酸調(diào)pH7.0);柱溫：35 ℃;流速：1.2 mL/min;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：298 nm。
2.1.2 空白脂質(zhì)體的制備
將HSPC、Chol按2∶1(質(zhì)量比)混合，加適量無(wú)水乙醇，65 ℃水浴中加熱溶解，揮除乙醇，加枸櫞酸緩沖液(0.3 mol/L，pH 4.30)，65 ℃水化30 min，用微射流儀循環(huán)數(shù)次，依次通過(guò)0.8和0.45 μm的微孔濾膜整粒，得空白脂質(zhì)體。將HSPC、Chol、CHSPEG2000按2∶1∶0.2(質(zhì)量比)混合，其他操作同上，得長(zhǎng)循環(huán)空白脂質(zhì)體。
2.1.3 硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體的制備
取空白脂質(zhì)體0.2 mL、硫酸長(zhǎng)春新堿溶液(1.0 g/L)1.0 mL和Na2HPO4溶液(0.375 mol/L;pH 9.0)0.8 mL混勻(pH 7.3)，于60 ℃孵化10 min，得硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體。取長(zhǎng)循環(huán)空白脂質(zhì)體同法操作，得長(zhǎng)循環(huán)硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體。
1.4 硫酸長(zhǎng)春新堿標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
取硫酸長(zhǎng)春新堿對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.1 g/L)，用70%(體積分?jǐn)?shù))甲醇配制成1.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 mg/L的系列溶液，濾過(guò)，HPLC測(cè)定;以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(ρ)線性回歸，得回歸方程A=14.5ρ+3.1(r=0.999 9)，線性范圍1.0～12.5 mg/L。
2.1.5 硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體藥物回收率測(cè)定
取0.8，1.0，1.2 g/L的硫酸長(zhǎng)春新堿溶液各1 mL，分別加入空白脂質(zhì)體0.2 mL和Na2HPO4溶液0.8 mL，制備不同濃度硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體。取各濃度脂質(zhì)體各0.3 mL分別置于5 mL量瓶中，以去離子水定容，搖勻，再取1.5 mL于5 mL量瓶中，以甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，HPLC法測(cè)定。代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算藥物含量，進(jìn)而計(jì)算回收率。結(jié)果表明，硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體中藥物回收率為 98.1%～101.8%。
2.1.6 硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體包封率的測(cè)定
1.2”中硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體0.3 mL兩份，一份置5 mL量瓶中，以去離子水定容，再取1.5 mL于5 mL量瓶中，以甲醇定容，混勻，濾過(guò);另一份上陽(yáng)離子樹脂柱，以去離子水洗脫，收集5 mL洗脫液，再取1.5 mL于5 mL量瓶中，以甲醇定容，混勻，濾過(guò)。HPLC測(cè)定，計(jì)算包封率：包封率=A過(guò)柱/A未過(guò)柱，其中A過(guò)柱表示脂質(zhì)體包封的硫酸長(zhǎng)春新堿的色譜峰面積;A未過(guò)柱表示總的硫酸長(zhǎng)春新堿的色譜峰面積。
結(jié)果表明，硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體的包封率為86.9%，長(zhǎng)循環(huán)硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體包封率提高到92.8%。
2.2 硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體體外釋放度的考察
2.2.1 分析方法建立
將4 mL空白脂質(zhì)體裝入預(yù)處理好的透析袋中，于37 ℃生理鹽水(100 mL)中透析10 h，取外層透析液用紫外分光光度計(jì)于298 nm測(cè)定吸光度(λVCR 297.8 nm)，吸收值為零。說(shuō)明空白脂質(zhì)體在10 h內(nèi)未通過(guò)透析袋，可采用透析法測(cè)定硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體的體外釋放度。
2.2.2 硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體體外釋放度的測(cè)定
取硫酸長(zhǎng)春新堿溶液、硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體和長(zhǎng)循環(huán)硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體各4 mL，分別加入預(yù)處理好的透析袋中，再分別置于37 ℃生理鹽水中透析，定時(shí)取透析液2 mL，并補(bǔ)加等量生理鹽水。將透析液濾過(guò)，測(cè)定藥物濃度，計(jì)算通過(guò)半透膜的藥物累積釋放量Mt，進(jìn)而計(jì)算累積釋放度，結(jié)果見圖1。
Mt=cnV0+∑ni=1ci-1V
其中，V0為釋放介質(zhì)體積,cn為第n次取樣時(shí)濃度,V為取樣體積。
圖1 硫酸長(zhǎng)春新堿溶液和脂質(zhì)體累計(jì)釋放度 Fig.1 Fractional release of vincristine sulfate liposomes
with different compositions
將硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體和長(zhǎng)循環(huán)硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體中藥物累積釋放度(F)對(duì)時(shí)間(t)線性擬合，方程分別為F=3.1t+0.9 (r=0.998 5)和F=0.8t+0.7 (r=0.998 0)，表明兩種脂質(zhì)體均符合零級(jí)釋藥模型。由方程斜率可知，CHSPEG2000修飾可降低脂質(zhì)體中藥物釋放速率，10 h硫酸長(zhǎng)春新堿的釋放度由32.43%降低到8.6%。
2.3 硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體血漿釋放度的考察
2.3.1 硫酸長(zhǎng)春新堿水溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
取硫酸長(zhǎng)春新堿對(duì)照品儲(chǔ)備液(1.0 g/L)，用去離子水配制成5.0，12.5，25.0，37.5，50.0 mg/L的系列溶液，各取2 mL于5 mL量瓶中,分別以甲醇定容。HPLC法測(cè)定，以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(ρ)進(jìn)行線性回歸，方程為A=19.0ρ+2.7(r=0.999 6)，線性范圍2.0～20.0 mg/L。
2.3.2 硫酸長(zhǎng)春新堿血漿溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
取硫酸長(zhǎng)春新堿對(duì)照品儲(chǔ)備液(1.0 g/L)用血漿配制成5.0，12.5，25.0，37.5，50.0 mg/L的系列溶液，各取2 mL于5 mL量瓶中甲醇定容，混勻，15 000 r/min離心5 min，取上清液過(guò)濾進(jìn)樣，得回歸方程A=18.3ρ+2.3(r=0.998 9)，線性范圍2.0～20.0 mg/L。
2.3.3 血漿中硫酸長(zhǎng)春新堿回收率的測(cè)定
配制5.0，10.0，15.0 mg/L的硫酸長(zhǎng)春新堿血漿溶液，按“2.3.2”方法操作，HPLC測(cè)定A，代入水溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線，求算藥物濃度，并計(jì)算回收率。結(jié)果表明，血漿中藥物回收率為97.9%～102.1% 。
2.3.4 陽(yáng)離子樹脂對(duì)血漿中硫酸長(zhǎng)春新堿的吸附
配制系列濃度的硫酸長(zhǎng)春新堿血漿溶液(40～120 mg/L)，37 ℃水浴孵化10 min，各取1 mL溶液，分別上陽(yáng)離子樹脂柱，以去離子水洗脫，收集洗脫液，取2 mL置于5 mL量瓶中，以甲醇定容，HPLC法測(cè)定。結(jié)果表明，過(guò)陽(yáng)離子樹脂的溶液未檢測(cè)出硫酸長(zhǎng)春新堿，說(shuō)明陽(yáng)離子交換樹脂能完全吸附血漿中游離和蛋白結(jié)合的硫酸長(zhǎng)春新堿，此法可以檢測(cè)脂質(zhì)體的血漿釋放度。
2.3.5 硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體血漿釋放度的測(cè)定
取硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體和長(zhǎng)循環(huán)硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體各4 mL(CVCR 0.5 g/L)，分別與20 mL血漿混勻，37 ℃定時(shí)取樣1 mL，上陽(yáng)離子樹脂柱，以去離子水洗脫，收集洗脫液，取2 mL于5 mL量瓶中，以甲醇定容。HPLC法測(cè)定，計(jì)算釋放度，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體和長(zhǎng)循環(huán)硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體在血漿中24 h分別釋放61.5%和51.4%。
2.4 硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體的藥效學(xué)研究
將復(fù)蘇的S180細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，約5 天抽出腹水用生理鹽水稀釋后傳代。將接種S180腫瘤的小鼠隨機(jī)分為4組：模型組、硫酸長(zhǎng)春新堿溶液組、硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體組、長(zhǎng)循環(huán)硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體組，每組10 只，右側(cè)腋下接種(0.2 mL/只)，第3、6、9、12 天尾靜脈注射給藥，第15 天將小鼠拉斷頸椎處死，剝離瘤體稱重。結(jié)果表明，各給藥組與模型組比較，差異均有顯著性(P0.01);長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體組與溶液組比較，差異有顯著性(P0.05)，而脂質(zhì)體組與溶液組差異則無(wú)顯著性，見表1。表1 各組瘤重結(jié)果
3 討 論
3.1 脂質(zhì)體血漿釋放度作為體外檢測(cè)手段可以為體內(nèi)釋放度的預(yù)測(cè)提供依據(jù)。本文采用陽(yáng)離子樹脂分離血漿中的脂質(zhì)體和硫酸長(zhǎng)春新堿，用HPLC法測(cè)定脂質(zhì)體包封的藥物含量，進(jìn)而計(jì)算硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體釋放度。結(jié)果表明，長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體比硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體藥物釋放度低，說(shuō)明長(zhǎng)循環(huán)硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體體內(nèi)循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)，更有利于發(fā)揮藥效。
3.2 藥效學(xué)試驗(yàn)中，用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組瘤重進(jìn)行多樣本均數(shù)間多重比較。結(jié)果表明，各給藥組與模型組比較，差異均有顯著性(P0.01);長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體組與溶液組比較，差異有顯著性(P0.05)，而脂質(zhì)體組與溶液組差異則無(wú)顯著性。其原因可能是，脂質(zhì)體靜脈給藥后易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)細(xì)胞，特別是單核吞噬細(xì)胞作為外來(lái)異物吞噬，且體內(nèi)成分會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)膜破壞，使藥物滲漏，不能更好發(fā)揮藥效;CHSPEG2000修飾的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體可以避開單核吞噬細(xì)胞的吞噬，使更多藥物到達(dá)腫瘤部位發(fā)揮療效。因此，長(zhǎng)循環(huán)硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體可以明顯提高抑瘤率，增強(qiáng)療效。
3.3 CHSPEG2000為本實(shí)驗(yàn)室合成的一種新型脂質(zhì)體修飾材料。脂質(zhì)體形成過(guò)程中，CHSPEG2000分子的膽固醇端嵌入脂質(zhì)體膜中，PEG端向外伸展形成親水層。在體外PEG層可以防止脂質(zhì)體因融合而造成的藥物滲漏和粒徑增大，并能提高脂質(zhì)體的包封率;在體內(nèi)PEG層可以防止脂質(zhì)體被巨噬細(xì)胞吞噬，有助于更好的發(fā)揮藥效。
【參考文獻(xiàn)】
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[3]趙妍，于彬，鄧意輝，等.主動(dòng)載藥法制備硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體及其包封率的測(cè)定[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2005，40(20):1 559.
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