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大黃對(duì)慢性腎功能不全大鼠保護(hù)機(jī)制的研究
【摘 要】 目的 觀察大黃對(duì)慢性腎功能不全大鼠腎功能及腎組織TGF-β1和smad7表達(dá)的影響。方法 采用腺嘌呤法建立大鼠慢性腎功能不全模型，治療組予以大黃(4 g/kg/d)灌胃。治療4 周后，檢測(cè)各組大鼠的24 小時(shí)尿蛋白定量、腎功能，通過(guò)組織學(xué)及蛋白印記觀察腎組織TGF-β1和smad7的表達(dá)。結(jié)果 治療組大鼠的24h尿蛋白定量、腎功能明顯增加(P<0.01)，而治療組大鼠24 h尿蛋白定量、腎功能較非治療組減少(P<0.05)。非治療組大鼠腎組織TGF-β1、smad7表達(dá)較正常組明顯增加(P<0.01)。結(jié)論 大黃可降低慢性腎功能不全大鼠24 小時(shí)尿蛋白、腎功能水平，抑制腎組織TGF-β1和smad7表達(dá)。大黃對(duì)慢性腎功能不全的保護(hù)機(jī)制可能與降低腎臟TGF-β1和smad7表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 大黃;慢性腎功能不全;腺嘌呤;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1;smad
[Abstract] Objective To study the effect of Dai Huang on glomerulosclerosis and expression of TGF-β1 and smad7 in rats with CRF. Methods Rats were divided into control group, not treated group and Dai Huang treated group with 20 rats in each group. The rats in the latter two groups were intragastric of Adenine. the treated group was fed with Dai Huang at a dose of 4g/(kg·d) for 4 weeks. Urine protein excretion, urea nitrogen and creatinine was measured. The expression of TGF-β1 and Smad7was measured. Results Compared with the control group, the not treated group showed higher urine protein excretion, urea nitrogen, creatinine(P<0.01)and expression of TGF-β1 and smad7. Conclusion Dai Huang can diminish urine protein excretion and prevent glomerulosclerosis in subtotally nephrectomized rats. This protective effect is presumed to be associated with its effect on expression of TGF-β1 and Smad7.
[Keywords] Dai Huang; Chronic renal failure; Adenine; TGF-β1; Smad7
大黃為蓼科植物掌葉大黃，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，大黃有抗血小板聚集、降血脂、清除氧自由基、提升超氧化物歧化酶(SOD)的活性，減輕免疫炎癥反應(yīng)的功效，同事具有瀉熱通便、解毒消癰、行瘀通經(jīng)功效。我們通過(guò)觀察大黃對(duì)慢性腎功能不全大鼠的治療，觀察其對(duì)尿蛋白排泄、腎功能的影響;并觀察其對(duì)腎組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)、smad7的蛋白表達(dá)及腎臟病理變化的影響，探討大黃對(duì)慢性腎功能不全的療效及作用機(jī)制。
1 材料與方法
1.1 材料
湖北產(chǎn)中藥材大黃。腺嘌呤(產(chǎn)品批號(hào)2007109)。兔抗TGF-β1、Smad7抗體;En Vision免疫組化試劑盒;BCA試劑盒。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和模型建立
雄性SD大鼠60 只，7 周齡，體重190±20 g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為正常組20 只和腺嘌呤組40只。腺嘌呤組每日腺嘌呤300 mg/kg灌胃，6 周后以代謝籠留取24 小時(shí)尿液，眶內(nèi)靜脈采血，測(cè)定24 小時(shí)尿蛋白定量、血尿素氮、血肌酐。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)全部造模成功。隨機(jī)分為2 組：非治療組20 只，治療組20 只。治療組大鼠每日給予黃葵膠囊[2 g/kg·d]灌胃，同時(shí)正常組和非治療組給予等量生理鹽水灌胃。4周后全部大鼠以代謝籠留取24 小時(shí)尿液，眶內(nèi)靜脈采血，測(cè)定24 小時(shí)尿蛋白定量、血尿素氮及肌酐。大鼠處死后取部分腎組織置于10%中性甲醛中固定，部分腎組織液氮保存用于蛋白印跡雜交方法(Western blot)檢測(cè)蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水、進(jìn)食。
1.3 檢測(cè)方法
1.3.1 尿蛋白定量及腎功能測(cè)定
1.3.2 病理形態(tài)學(xué)觀察
腎組織經(jīng)10%中性甲醛固定，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸臘、包埋、切片，厚3 µm，行HE染色，觀察腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化的程度。
1.3.3 蛋白印記分析
各組取約100 mg腎組織置于1 ml裂解緩沖液(含蛋白酶抑制劑PMSF 100ug/ul，aprotinin 1 ug/ml，leupeptin 1 ug/ml)，勻漿后冰浴30 分鐘，然后4 度12000 g離心20 分鐘。提取蛋白后用BCA法測(cè)量蛋白濃度。取等量蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)移至聚氟乙烯膜上，封閉液封閉，加入1：200稀釋的 TGF-β1抗體，4 ℃過(guò)夜。0.05%TBST洗膜3 次，ECL顯影。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P <0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(方差齊時(shí)用LSD法、方差不齊時(shí)用Tamhane法)。
2 結(jié)果
2.1 尿蛋白定量變化
非治療組和治療組大鼠尿蛋白排泄明顯高于正常組(P <0.01);治療組大鼠尿蛋白定量與非治療組比較有所降低(P <0.05)，見表1。
2.2 血清生化指標(biāo)變化
非治療組和治療組大鼠血肌酐明顯高于正常組(P <0.01);治療組大鼠血肌酐與非治療組比較有所降低(P <0.05);尿素氮變化同血肌酐變化，見表1。
表1 各組大鼠尿蛋白定量、血尿素氮、肌酐水平( )
組別 n 尿蛋白定量(mg/d) 尿素氮(mmol/L) 肌酐(µmol/L)
正常組 20 9.24±2.16 7.26±1.03 48.26±9.36
非治療組 20 169.36±27.69* 18.57±3.89* 119.41±15.86*
治療組 20 89.1±17.34*▲ 14.18±5.34*▲ 80.64±12.25*▲
*與正常組相比，P<0.01，▲與非治療組相比，P<0.05。
2.3 組織病理學(xué)改變
在HE染色中，非治療組大鼠可見明顯的腎小球增生，系膜增殖，腎小球毛細(xì)血管部分塌陷，球囊粘連，部分腎小球完全硬化，間質(zhì)有炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分腎小管已萎縮，系膜外基質(zhì)顯著增加(圖1)。治療組與非治療組比較，腎小球損傷、硬化輕，腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)少，間質(zhì)纖維化。
2.4 腎組織TGF-β1和smad7用蛋白印記方法檢測(cè)結(jié)果
治療組和非治療組大鼠相比TGF-β1表達(dá)下調(diào)，而smad7表達(dá)上調(diào)。見圖2。
3 討論
慢性腎功能不全是所有腎臟疾病進(jìn)展的共同結(jié)局，其實(shí)質(zhì)是腎臟纖維化，嚴(yán)重威脅人類健康。目前研究表明，TGF-β1和其受體下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子Smad7蛋白在促進(jìn)腎小球纖維化及腎小管間質(zhì)纖維化方面起重要作用。
TGF-β1 是迄今已知作用最強(qiáng)的一種促腎纖維化的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分泌、遷移和凋亡等多種生物學(xué)活性。TGF-β1在腎纖維化中的作用涉及到細(xì)胞外基 (ECM)、細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)分化、炎癥浸潤(rùn)等各個(gè)環(huán)節(jié)，是介導(dǎo)腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化關(guān)鍵細(xì)胞因子，在腎纖維化過(guò)程中TGF-β1起著關(guān)鍵作用[2]。
正常組 非治療組 治療組
圖2 Western blot檢測(cè)各組大鼠TGF-β1和smad7蛋白表達(dá)結(jié)果
目前認(rèn)為，Smad7主要通過(guò)與TGF-β1型受體結(jié)合抑制TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以往在許多腎臟疾病如腎小球腎炎、腎病綜合征、狼瘡性腎炎、糖尿病腎病等的動(dòng)物模型和人的腎活檢標(biāo)本的研究中，都提示TGFβ1/Smad7信號(hào)通路被激活，用抗TGF-β1的抗體或Smad7轉(zhuǎn)基因治療時(shí)，慢性腎臟病的腎臟纖維化得到改善，提示Smad7信號(hào)通路在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[3]。
現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)表明大黃能抑制TGF—β1的過(guò)度表達(dá)，減緩腎功能惡化速度，而被被廣泛用于治療慢性腎小球腎炎和慢性腎衰竭[4]。慢性腎功能不全的實(shí)質(zhì)是腎臟纖維化，而TGF-β1是促腎纖維化最重要的細(xì)胞因子，smad7 蛋白是TGF-β1受體的胞內(nèi)激酶底物，在調(diào)節(jié)TGF-β1促腎纖維化過(guò)程中起重要作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大黃可能通過(guò)減少腺嘌呤致慢性腎功能不全大鼠的 TGF-β1及增加smad7蛋白表達(dá)，來(lái)減緩甚至抑制腎小球及腎間質(zhì)纖維化;降低大鼠24 小時(shí)尿蛋白定量、血尿素氮及血肌酐;減輕慢性腎功能不全大鼠腎病組織的病理改變，延緩慢性腎功不全進(jìn)入終末期腎衰竭的時(shí)間。
參考文獻(xiàn)
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