金納多對RCS鼠視網(wǎng)膜色素變性神經(jīng)元保護(hù)作用

　　【摘要】 目的 探討金納多(Ginaton，EGb761)對RCS大鼠視網(wǎng)膜色素變性神經(jīng)元保護(hù)作用的機(jī)制。方法將出生后雄性RCS大鼠48只隨機(jī)分為給藥組和對照組。給藥組大鼠從生后7 d開始腹腔注射金納多，每3 d注射一次，劑量為100 mg/kg。對照組大鼠注射生理鹽水，劑量相同。蘇木精伊紅染色和TUNEL檢測觀察EGb761對視網(wǎng)膜色素變性神經(jīng)元的保護(hù)作用。應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測Caspase2蛋白的表達(dá)。結(jié)果 給藥組大鼠生后20和25 d，感光細(xì)胞的數(shù)目與對照組大鼠比較明顯增加(t=3.32、3.56,P<0.05)。給藥組大鼠生后25 d TUNEL檢測陽性細(xì)胞數(shù)目比對照組少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.74,P<0.05)。生后25～40 d，給藥組和對照組大鼠在節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層觀察到Caspase2陽性染色。給藥組大鼠生后20和25 d時內(nèi)核層Caspase2陽性細(xì)胞數(shù)少于對照組(t=2.87,P<0.05)。結(jié)論 在RCS大鼠視網(wǎng)膜變性的早期，EGb761對神經(jīng)元起保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與Caspase2蛋白的低表達(dá)有關(guān)。

　　【關(guān)鍵詞】 視網(wǎng)膜炎 色素性 金納多 細(xì)胞凋亡 Caspase2蛋白 大鼠

　　[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the protective mechanisms of Ginaton (EGb761) on hereditary retinal dystrophy in RCS rats.MethodsA total of 48 male RCS rats were randomly divided into treated and control groups. EGb761 100 mg/kg was injected intraperitoneally, once every three days in treated group， starting from seven days after birth; saline was given to the controls, dose and medication being the same as the treated group. The protective effect of EGb761 against retinal dystrophy was assessed by HE staining and TUNEL. The expression of Caspase2 was detected by immunohistochemistry. ResultsThe number of photoreceptor in the treated group was more than that in the controls at 20 and 25 days after birth (t=3.32,3.56;P<0.05). Twentyfive days after birth, the number of TUNELpositive cells of the treated group was obviously less than that of the controls (t=3.74,P<0.05). From 25 to 40 days after birth, the Caspase2positive cells were seen in the ganglion cell layer and inner nuclear layer in both treated and control groups. The number of positive cells in the inner nuclear layer of treated group was less than that of the control group (t=2.87,P<0.05). ConclusionEGb761 has a protective effect on the early stage of retinal degeneration of RCS rats, its mechanisms may be related to the low expression of Caspase2.

　　[KEY WORDS]retinitis pigmentosa; EGb761; apoptosis; Caspase2 protein; rats

　　視網(wǎng)膜色素變性是一種眼科十分常見的致盲性疾病，到目前為止，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，亦無有效的防治辦法。1938年，BOURNE等[1]首次報道了自發(fā)性蛻變的鼠種——RCS(Royal College of Surgeons)大鼠，人們基于這一動物模型進(jìn)行了大量研究。RCS大鼠主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)不能有效吞噬感光細(xì)胞外節(jié)脫落的膜盤，致使膜盤堆積，感光細(xì)胞變性[2]。隨著凋亡概念的提出，1994年TSO等[2]認(rèn)為RCS大鼠感光細(xì)胞變性是通過凋亡的途徑實現(xiàn)的。金納多(Ginaton，EGb761)是從銀杏葉中提取的復(fù)合物，可以增加腦血管的血流量，保護(hù)腦細(xì)胞，清除有害的氧化自由基，并有顯著的抗凋亡作用[3]。本實驗從感光細(xì)胞開始凋亡時觀察EGb761對神經(jīng)元的保護(hù)作用，并探討EGb761的作用機(jī)制，為臨床上日益增多的視網(wǎng)膜色素變性疾病的治療提供實驗和理論依據(jù)。

　　1 材料與方法

　　1.1 組織來源

　　出生后雄性RCS大鼠48只，隨機(jī)分為給藥組和對照組。12 h光照12 h黑暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)，自由飲食、飲水。給藥組大鼠從生后7 d開始腹腔注射EGb761，每3 d注射一次，劑量為100 mg/kg。對照組大鼠從生后7 d開始腹腔注射同劑量生理鹽 水。兩組大鼠分別在生后15、20、25、30、35、40 d處死，取其視網(wǎng)膜組織，觀察EGb761對感光細(xì)胞的保護(hù)作用。

　　1.2 標(biāo)本制作

　　水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉動物后，取出眼球，沖洗后立即放入40 g/L多聚甲醛中固定6 h，去眼前節(jié)及玻璃體，依次放入100 g/L蔗糖中2 h，200 g/L蔗糖中2 h，300 g/L蔗糖中過夜。用OCT包埋劑填滿眼球,沿眼球矢狀面作連續(xù)冷凍切片，厚度5 μm，依次行蘇木精伊紅、TUNEL、Caspase2染色。

　　1.3 檢測方法

　　原位細(xì)胞凋亡檢測和Caspase2免疫組化檢測均按常規(guī)操作。原位細(xì)胞凋亡檢測陰性對照切片不加末端核糖核酸轉(zhuǎn)移酶，陽性對照切片在反應(yīng)前先用DNA酶Ⅰ消化。Caspase2免疫組化檢測陰性對照切片不加一抗。

　　1.4 結(jié)果判定

　　采用激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS,IX81)獲得數(shù)值顯微圖像。用8比特1 024×1 024像素的20倍放大的顯微圖像。TUNEL陽性表達(dá)為細(xì)胞核呈綠色熒光，測量視網(wǎng)膜每100 μm長視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)。Caspase2陽性表達(dá)為細(xì)胞膜或胞漿呈黃色或棕黃色染色。每張切片取4個視野，用光學(xué)顯微鏡在200倍視野下觀察，計數(shù)每 100 μm長視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)。

　　2 結(jié) 果

　　2.1 蘇木精伊紅染色

　　2.1.1 對照組 大鼠生后15 d視網(wǎng)膜還未發(fā)育成熟。20 d時，視桿層厚度增加，內(nèi)節(jié)變窄，外節(jié)增厚，有排列紊亂及空泡現(xiàn)象。25 d時，感光細(xì)胞數(shù)目有所下降。30 d時，感光細(xì)胞染色加深，其數(shù)目減少，外節(jié)形態(tài)不規(guī)則，內(nèi)節(jié)明顯變窄。35 d時感光細(xì)胞數(shù)目與30 d相比明顯減少。40 d時，感光細(xì)胞數(shù)目與35 d相比明顯減少，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可見排列紊亂，體積增大，外形不規(guī)則。60 d時，僅有少許感光細(xì)胞存在，平均細(xì)胞計數(shù)為(9.80±2.59)個。內(nèi)核層(INL)細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞形態(tài)和數(shù)目基本正常。

　　2.1.2 給藥組 大鼠生后15 d，外核層(ONL)感光細(xì)胞數(shù)目與對照組大鼠相比無明顯差別(t=1.36，P>0.05)。20 d時，感光細(xì)胞數(shù)目比對照組細(xì)胞數(shù)目多(t=3.32,P<0.05)。25 d時，給藥組大鼠感光細(xì)胞數(shù)目較20 d時有所下降，但與對照組相比明顯增加(t=3.56,P<0.05)。見表1。

　　2.2 TUNEL檢測

　　對照組大鼠生后25 d，ONL可以觀察到少許TUNEL反應(yīng)陽性的細(xì)胞核。30 d時，TUNEL反應(yīng)陽性細(xì)胞核數(shù)目明顯增加。35 d時陽性細(xì)胞核數(shù)目最多。40 d時，陽性細(xì)胞核數(shù)目較35 d時減少。給藥組大鼠生后25 d，ONL也可以觀察到TUNEL反應(yīng)陽性的細(xì)胞核，陽性細(xì)胞計數(shù)與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.74,P<0.05)。其余時間段無明顯差異。見表2。

　　2.3 Caspase2檢測

　　生后20～40 d，給藥組和對照組大鼠在節(jié)細(xì)胞層和INL觀察到Caspase2陽性染色。給藥組大鼠在20 d和25 d時INL的Caspase2陽性細(xì)胞數(shù)多于對照組(t=2.87,P<0.05)，其余各時間段差異無顯著性。給藥組、對照組大鼠INL的 Caspase2染色陽性細(xì)胞均在生后35 d達(dá)到高峰。見表3。表1 兩組不同日齡大鼠視網(wǎng)膜每30 μm長視野內(nèi)ONL感光細(xì)胞數(shù)目的變化表2 兩組不同日齡大鼠視網(wǎng)膜每100 μm長視野內(nèi)TUNEL檢測陽性細(xì)胞數(shù)表3 兩組不同日齡大鼠視網(wǎng)膜每100 μm長視野內(nèi)INL的Caspase2陽性細(xì)胞數(shù) 3 討 論

　　EGb761俗稱銀杏黃酮，主要含黃酮甙、萜內(nèi)酯、白果內(nèi)酯。自從被發(fā)現(xiàn)以來臨床上廣泛用于治療腦部、外周等血液循環(huán)障礙。然而近年來許多研究表明,EGb761在缺血、低氧以及非自然原因凋亡所致?lián)p傷的保護(hù)作用中發(fā)揮著重要作用。有研究證實,EGb761對羥自由基誘導(dǎo)的大鼠腦神經(jīng)細(xì)胞的 凋亡有抑制作用[4]。BEHARCOHEN等[5]的實驗證實了NO參與了亞硝酸鹽細(xì)胞毒性對培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的作用，EGb761作為一種自由基清除劑可保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞免受亞硝酸鹽細(xì)胞毒性的損傷。EGb761還可以延緩白內(nèi)障動物模型中眼球混濁的進(jìn)程，可能有抗白內(nèi)障的有益作用。FIES等[6]發(fā)現(xiàn)EGb761對老年黃斑變性導(dǎo)致的視力受損有治療作用。這些均為EGb761對遺傳性視網(wǎng)膜色素變性可能的治療作用提供了依據(jù)。

　　自從首次報道RCS大鼠以來，人們對這一動物模型視網(wǎng)膜色素變性導(dǎo)致感光細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行了大量研究。劉斌等[7]報道，RCS大鼠出生后25 d時，視網(wǎng)膜PRC內(nèi)節(jié)處偶見有P53陽性染色，30 d時PRC胞質(zhì)內(nèi)有明顯的陽性染色顆粒，主要位于內(nèi)節(jié)，外節(jié)處為陰性，少許PRC細(xì)胞核呈陽性染色。RCS大鼠出生后30 d P53蛋白呈強(qiáng)陽性，提示PRC的凋亡可能為P53依賴性。遲煥芳等[8]研究顯示,RCS大鼠視網(wǎng)膜變性過程中bcl2原癌基因可能不參與感光細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。目前對視網(wǎng)膜色素變性的治療方法主要有基因治療、感光細(xì)胞移植、藥物干預(yù)。前兩種方法因目前尚難解決的一些技術(shù)問題使其應(yīng)用受到很大限制，而藥物干預(yù)則通過影響視網(wǎng)膜色素變性形成過程中一些代謝變化而顯示了良好的應(yīng)用前景。本實驗中我們觀察到,給藥組大鼠在生后20、25 d外核層感光細(xì)胞的數(shù)目比對照組多(P<0.05)，提示EGb761在RCS大鼠感光細(xì)胞變性的早期對感光細(xì)胞有保護(hù)作用。但研究結(jié)果還表明，RCS大鼠出生25 d以后，給藥組和對照組視網(wǎng)膜感光細(xì)胞存留數(shù)目的差別無顯著性，這可能是由于RCS大鼠生后25 d感光細(xì)胞發(fā)生凋亡，35 d是感光細(xì)胞凋亡的高峰期。TUNEL檢測表明，給藥組大鼠視網(wǎng)膜在25 d時凋亡的細(xì)胞數(shù)比對照組減少(P<0.05)，余時間段兩者差異無顯著意義。本實驗結(jié)果提示，EGb761對感光細(xì)胞早期凋亡有抑制作用。

　　Caspase即半胱氨酸天冬氨酸酶，通常以無活性的蛋白酶原形式在細(xì)胞內(nèi)合成和分泌。在放射線、氧化損傷、缺血低氧等誘導(dǎo)凋亡信號的刺激下，酶原形成四聚體而活化，形成Caspase活化級聯(lián)反應(yīng)。Caspase一經(jīng)激活裂解其作用底物，細(xì)胞凋亡便不可逆地進(jìn)入實施階段，并以細(xì)胞解體、凋亡小體形成而告終。Caspases2檢測顯示,生后25～40 d，給藥組和對照組大鼠在節(jié)細(xì)胞層和INL觀察到Caspase2陽性染色。給藥組在20、25 d時INL的Caspase2陽性細(xì)胞數(shù)少于對照組(P<0.05)。給藥組和對照組INL Caspase2陽性細(xì)胞數(shù)均在35 d達(dá)到高峰，其趨勢與TUNEL檢測相一致。結(jié)果提示，EGb761對凋亡抑制作用可能與抑制Caspase2蛋白的表達(dá)有關(guān)。

　　視網(wǎng)膜色素變性是一種發(fā)病年齡早、病程進(jìn)展慢、對視力影響大的遺傳性致盲眼病。多種突變基因干擾了感光細(xì)胞內(nèi)光電轉(zhuǎn)化反應(yīng)和能量代謝，并通過不同途徑，激活視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞及感光細(xì)胞內(nèi)程序化死亡過程。但迄今為止，視網(wǎng)膜色素變性一直沒有有效的藥物治療。本實驗在RCS大鼠不同鼠齡段注射EGb761，通過TUNEL及凋亡相關(guān)因子檢測，結(jié)果顯示EGb761能抑制感光細(xì)胞早期神經(jīng)元的凋亡。EGb761對神經(jīng)元具有保護(hù)作用，臨床應(yīng)用較為安全，因此，將來或許可以把EGb761作為視網(wǎng)膜色素變性的治療藥物之一。

　　【參考文獻(xiàn)】

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　　[3] SMITH J V, BURDICK A J, GOLIK P, et al. Antiapoptotic properties of Ginkgo biloba extract EGb761 in differentiated PC12 cells[J]. Cell Mol Biol (Noisylegrand), 2002, 48(6):699707.

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　　[5] BEHARCOHEN F F, HEYDOLPH S. Peroxynitrite cytotoxicity on bovine retinal pigmented epithelial cells in culture[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1996,226(3):842849.

　　[6] FIES P, DIENEL A. Ginkgo extract in impaired vision——treatment with special extract EGb761 of impaired vision due to dry senile macular degeneration [J]. Wien Med Wochenschr, 2002,152(15/16):423426.

　　[7] 劉斌,朱秀安. 遺傳性視網(wǎng)膜變性感光細(xì)胞凋亡與P53蛋白表達(dá)[J]. 北京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 1998,30(2):110112.

　　[8] 遲煥芳,喬淑紅,曹文強(qiáng). RCS大鼠感光細(xì)胞凋亡與Bcl2蛋白表達(dá)[J]. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2003,39:123126.

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