- 相關(guān)推薦
濱州市部分地面水體細(xì)菌耐藥性分析
【摘要】 目的 為了了解濱州市內(nèi)地面水體中細(xì)菌的耐藥性，并探討其與耐藥質(zhì)粒譜之間的關(guān)系。方法 采集濱州市內(nèi)4個(gè)地面水體的水樣，分別檢測(cè)水樣菌落形成單位(colonyforming unit，CFU)以及氨芐青霉素耐藥率，用KB法對(duì)氨芐青霉素耐藥菌株分別做7種不同抗生素的藥敏試驗(yàn)，然后提取這些菌株的質(zhì)粒，用EcorI酶切質(zhì)粒電泳后分析酶切質(zhì)粒譜。結(jié)果 樣本氨芐青霉素耐藥率達(dá)11?7%~49?8%。氨芐青霉素耐藥菌株對(duì)其他3種不同的抗生素分別有12?5%~25%不等的耐藥性，未找到耐西拉司丁鈉的菌株。耐氨芐青霉素以及一種非β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的菌株占32?5%，耐氨芐青霉素以及兩種或者以上的非β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的菌株占20%。酶切質(zhì)粒譜共找到從815 bp~12?2 kb的63種大小不等的酶切片斷。結(jié)論 濱州市地面水體中細(xì)菌耐藥性普遍存在，且多重耐藥性明顯;對(duì)細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測(cè)是十分有意義而且有必要的。
【關(guān)鍵詞】 地面水體;細(xì)菌耐藥性;質(zhì)粒譜
【Abstract】 Objective To survey the condition of antibiotic resistance in ground water body of Binzhou, and to study its relationship with plasmid profiles.Methods Water samples were collected from 4 places of ground water body of Binzhou, then CFU was counted and the antibiotic resistance rate was analyzed. KB method was used to practice the susceptibility test with 5 antibiotics, then the antibiotic resistance spectrums were analyzed.Results The ampicillin resistance rate of the samples varies from 11?7% to 49?8%. The ampicillin resistant isolates have different antibiotic resistance rate which varies from 12?5% to 25% relevant to 3 other antibiotics，and the cilastain resistance was not found . Isolates with the trait of ampicillin resistance and one nonβlactam antibiotic reached 32?5%, and isolates with the trait of resistant to ampcillin and two or more nonβlactam antibiotics reached 20%. There are 63 plasmids bands which varys from 815bp to 12?2kb in plasmid profiles.Conclusion The antibiotic resistance in ground water body of Binzhou was prevalent, and the phenomenon of multidrug resistance is obvious too. It is significant and necessary to monitor the antibiotic resistance status .
【Key words】 ground water body, drug resistance of bacteria, multidrug resistance
在自然界中，細(xì)菌的耐藥性是普遍存在的。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中抗生素的大量使用，在自然選擇壓力下，細(xì)菌的耐藥性也越來(lái)越強(qiáng)，再加上耐藥基因的傳代、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散，耐藥菌越來(lái)越多，耐藥程度不斷增加，形成高度和多重耐藥。大量研究表明質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移在細(xì)菌多重耐藥性的形成中起了重要作用[1]。通過(guò)這種水平轉(zhuǎn)移，細(xì)菌的耐藥性擴(kuò)散迅速、廣泛，耐藥株可自身克隆擴(kuò)散，也可與敏感株進(jìn)行遺傳物質(zhì)交換。這種現(xiàn)象在自然水體中廣泛地存在，這使多重耐藥性成為一個(gè)世界范圍內(nèi)的問(wèn)題，造成和加劇了對(duì)新的抗菌藥物的需求。本課題的研究目的就是要了解濱州市部分地面水體中細(xì)菌耐藥性的特點(diǎn)，并分析該地區(qū)細(xì)菌耐藥性與細(xì)菌質(zhì)粒譜的關(guān)系。
1 材料與方法
1.1 主要試劑 常規(guī)LuriaBertani(LB)培養(yǎng)基。Mueller Hinton(MH)瓊脂培養(yǎng)基、藥敏紙片、0.5麥?zhǔn)媳葷峁艿荣?gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922由浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室提供。
1.2 主要儀器 普通超凈工作臺(tái)，柯達(dá)電子成像和分析系統(tǒng)120(柯達(dá)公司)，Gelpro Analyzer 4?0(Media Cybernetic公司)。
1.3 方法
1.3.1 采集水樣：用滅菌的吸量管采集水樣。每個(gè)水體中采5個(gè)水樣，每個(gè)水樣采集點(diǎn)之間的距離超過(guò)100 m，每個(gè)水樣采集10 ml，并記錄水溫。
1.3.2 檢測(cè)水樣菌落形成單位(CFU)以及氨芐青霉素耐藥率： 稀釋水樣至1∶10和1∶100,將稀釋的水樣分別培養(yǎng)到LB瓊脂和氨芐青霉素(終濃度60 μg/ml)+LB瓊脂培養(yǎng)基中(每個(gè)培養(yǎng)皿中0?1 ml的稀釋后水樣)，然后在37 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后分別計(jì)數(shù)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)目(采用柯達(dá)電子成像和分析系統(tǒng)120攝像后用Gelpro Analyzer 4?0自動(dòng)計(jì)數(shù))。
1.3.3 KB法藥敏實(shí)驗(yàn)：將耐氨芐青霉素組的菌株進(jìn)行純培養(yǎng)(37 ℃，氨芐青霉素+LB瓊脂培養(yǎng)基中24 h)，之后從每個(gè)培養(yǎng)皿中挑取兩個(gè)遠(yuǎn)離的菌落各自放入盛有3 ml 氨芐青霉素+MH肉湯的試管中，在37 ℃的搖床中搖約3 h。從每個(gè)試管中取1 ml菌液，用生理鹽水稀釋至0?5 MacFarland標(biāo)準(zhǔn)濁度;另外的2 ml菌液繼續(xù)在37 ℃搖床中培養(yǎng)過(guò)夜。用棉簽將稀釋的菌液涂布在MH瓊脂培養(yǎng)基上，美國(guó)NCCLS藥敏實(shí)驗(yàn)紙片擴(kuò)散法[2]對(duì)每個(gè)菌株進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)采用的抗生素有氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素、左氧氟沙星、西拉司丁鈉。
1.3.4 酶切質(zhì)粒譜分析：將過(guò)夜培養(yǎng)的菌株用堿裂法制備少量質(zhì)粒DNA[3]，將質(zhì)粒用EcorI酶切后在0.7%凝膠瓊脂糖平板上加樣電泳[4]，以1 kb Gene Ladder作為標(biāo)準(zhǔn)，10 V/cm穩(wěn)壓電泳1 h，在柯達(dá)凝膠成像系統(tǒng)中攝影后，獲取照片后使用Gelpro Analyzer 4?0 分析。
2 結(jié)果
2.1 水樣CFU以及氨芐青霉素耐藥率 從4個(gè)水體中采集到的20個(gè)水樣中細(xì)菌CFU和氨芐青霉素耐藥率見(jiàn)表1，從表中我們可以看到4個(gè)水體中的細(xì)菌CFU已經(jīng)較高，而且細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素的耐藥率也相當(dāng)高。
表1 水體中細(xì)菌CFU和氨芐青霉素耐藥率水體nalogCFU/mlb氨芐青霉素耐藥率(略)
2.2 藥敏試驗(yàn) 通過(guò)紙片法藥敏實(shí)驗(yàn)得到的氨芐青霉素耐藥菌株對(duì)其它抗生素的耐藥譜見(jiàn)表2。從表2中我們看到不同細(xì)菌對(duì)多種抗生素具有耐藥性，而未發(fā)現(xiàn)作為碳青霉烯類(lèi)的西拉司丁鈉有耐藥菌株。
表2 氨芐青霉素耐藥菌株對(duì)其它抗生素的耐藥性水體測(cè)試 略
2.3 酶切質(zhì)粒譜 我們把提取的15個(gè)質(zhì)粒樣本經(jīng)EcorI酶切電泳后得到14個(gè)條帶，質(zhì)粒檢出率為93?3%。由于采用了1 kb Gene Ladder作為標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)過(guò)EcorI酶切電泳得到的膠帶攝片后經(jīng)過(guò)Gelpro Analyzer 4?0分析，找到815 bp~12?2 kb的63種大小不等的酶切片斷，質(zhì)粒最少具有3個(gè)酶切片斷，最多具有10個(gè)酶切片斷。其中13個(gè)質(zhì)粒具有12?2 kb片斷，10個(gè)質(zhì)粒具有12?1 kb酶切片斷，9個(gè)質(zhì)粒具有10?5 kb酶切片斷，4個(gè)質(zhì)粒含有8?9 kb酶切片斷。
3 討論
從我們所調(diào)查的4個(gè)水體來(lái)看，除中海外,濱州市地面水體中細(xì)菌含量偏高，而且細(xì)菌存在對(duì)氨芐青霉素等常用抗生素的廣泛耐藥，這個(gè)與國(guó)內(nèi)普遍存在的醫(yī)療單位和養(yǎng)殖業(yè)濫用抗生素現(xiàn)象不無(wú)關(guān)系[5]。國(guó)內(nèi)外很多資料顯示在河流[6]、下水道[7]、屠宰場(chǎng)[8]和魚(yú)[9]、家禽等體內(nèi)普遍存在耐藥性細(xì)菌。耐藥性產(chǎn)生的直接后果是嚴(yán)重影響了臨床療效，增加了治療成本，同時(shí)縮短新藥的應(yīng)用周期，增大了新藥的研究與開(kāi)發(fā)成本，尤其在人畜同藥的情況下，耐藥性通過(guò)畜產(chǎn)品以及環(huán)境等途徑引起的交叉?zhèn)鞑�，直接�?duì)人體健康構(gòu)成威脅。因而，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注。從目前的研究來(lái)看，細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性的機(jī)制主要有以下幾個(gè)方面[10]：①產(chǎn)生滅活酶或鈍化酶，使抗生素在達(dá)到作用部位前即被破壞或失活。②細(xì)菌改變細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，使抗生素?zé)o法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)到達(dá)作用部位而不能發(fā)揮抗菌效能。③改變靶位,使不易為抗生素所作用。如細(xì)菌改變青霉素結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)或產(chǎn)生新的青霉素結(jié)合蛋白減少與 β內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的親合力而耐藥。④細(xì)菌還可通過(guò)提高生物合成抗生素拮抗物的量而耐藥。細(xì)菌的耐藥基因可以通過(guò)染色體介導(dǎo)，更重要的是可以通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)。
耐藥質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、易位或轉(zhuǎn)座等方式在微生物間轉(zhuǎn)移造成耐藥因子增多，從而不但可以在同種間傳播，而且可以在不同種及非致病菌間傳播，造成院內(nèi)和院外感染流行，大大增加細(xì)菌耐藥問(wèn)題的嚴(yán)重性。在實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)很多細(xì)菌具有多重耐藥性，即一種細(xì)菌具有對(duì)多種不同類(lèi)型的抗生素具有耐藥性。關(guān)于產(chǎn)生多重耐藥性的機(jī)制，過(guò)去一般認(rèn)為細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性與抗菌藥的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制有關(guān),并通過(guò)質(zhì)粒攜帶的耐藥基因擴(kuò)散耐藥性，同類(lèi)結(jié)構(gòu)藥物或作用機(jī)制相似的藥物具有部分或全部交叉耐藥性。然而,近幾年隨著分子生物學(xué)手段的不斷應(yīng)用，人們開(kāi)始從三個(gè)層面來(lái)認(rèn)識(shí)細(xì)菌的耐藥性，上述的細(xì)菌耐藥機(jī)制可作為第一層面;第二層面則是由于細(xì)菌長(zhǎng)期接觸藥物，引起菌體細(xì)胞膜孔蛋白的丟失，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性下降，引起低度耐藥;而第三層面則是細(xì)菌細(xì)胞膜上的外排泵(主動(dòng)外排系統(tǒng))的表達(dá)水平不斷提高，能主動(dòng)將擴(kuò)散入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的藥物或其它底物泵出細(xì)胞外，從而使細(xì)菌獲得耐藥性。細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性下降僅能引起低度耐藥性,細(xì)菌形成多重耐藥性主要與細(xì)菌中存在的外排泵有關(guān)[10]。二者所產(chǎn)生的協(xié)同作用使細(xì)菌產(chǎn)生了對(duì)多種抗菌藥的高度耐藥性即高水平的多重耐藥性。從酶切質(zhì)粒譜結(jié)果來(lái)看，我們發(fā)現(xiàn)在耐氨芐青霉素菌株中12.2 kb的酶切片斷和12.1 kb的酶切片斷大量存在，這些片斷可能與細(xì)菌耐氨芐青霉素的特性存在一定聯(lián)系，而更明確的耐藥譜與質(zhì)粒譜之間的關(guān)系，尚需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是具有局限性的[11]，它僅僅代表一部分可以在有氧環(huán)境和特定培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)菌，那些未被培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)菌同樣可能具有一定的耐藥性，而且其也可能作為耐藥基因的載體而傳播細(xì)菌的耐藥性。
【參考文獻(xiàn)】
[1] Thomas DJ, Morgan JA, Whipps JM ，et al. Plasmid transfer between bacillus thuringiensis subsp israelensis strains in laboratory culture, river water, and dipteran larvae[J].Appl and Environ Microbiol，2001,67 (1):330338.
[2] National Committee for Clinical Laboratory Standards, Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests M2A6[S].Wayne(PA): The Committee, 1997.
[3] 徐兆煒. 國(guó)內(nèi)腸道致病菌耐藥性質(zhì)粒研究進(jìn)展[J].上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，1994,6(1):7.
[4] 魏旭蘭，羅明，潘若男. 細(xì)菌質(zhì)粒電泳分析技術(shù)及其注意事項(xiàng)[J].江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，1999，17(4)：230 231.
[5] 李?lèi)?ài)華.水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的抗菌藥物及細(xì)菌耐藥性[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2002,9 (1):8791.
[6] Ash R.J, Mauck M B, Morgan. Antibiotic resistance of gramnegative bacteria in rivers[J]. US Emerg Infect Dis, 2002,8 (7):713716.
[7] Iversen A, Kuhn I, FranklinR A.et al. High prevalence of vancomycinresistant enterococci in Swedish sewage[J].Appl Environ Microbiol， 2002,68 (6):28382842.
[8] Carraminana JJ, Rota C, AgustinA I，et al. High prevalence of multiple resistance to antibiotics in Salmonella serovars isolated from a poultry slaughterhouse in Spain Veterinary[J].Microbiology, 2004,104 (12):133139.
[9] MirandaR CD，Zemelman. Antibiotic resistant bacteria in fish from the Concepcion Bay[J].Chile Marine Pollution Bulletin,2001,42 (11):10961102.
[10] 馬紅霞,鄧旭明,歐陽(yáng)紅生.細(xì)菌多重耐藥分子機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)藥抗生素分冊(cè),2002,5:2326.
[11] 朱華慶，王雪，張素梅,等.限制性?xún)?nèi)切酶酶切及限制性?xún)?nèi)切酶酶切圖譜分析[J]. 安徽大學(xué)學(xué)報(bào)，2003,4:3842.
【濱州市部分地面水體細(xì)菌耐藥性分析】相關(guān)文章：
銅綠假單胞菌107株耐藥性分析03-02
試析道路瀝青對(duì)水體危害性分析12-25
醫(yī)院內(nèi)與醫(yī)院外感染葡萄球菌的耐藥性分析11-20
尿路感染患者病原菌的分布及耐藥性分析03-08
基層醫(yī)院外科感染常見(jiàn)病原菌耐藥性分析12-09