博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化過(guò)程中羥脯氨酸及氧化應(yīng)激指標(biāo)
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【Abstract】 AIM: To discuss the changes of hydroxyproline and the role of oxidationantioxidation disequilibrium in pulmonary fibrosis induced by bleomycin (BLM) in rats. METHODS: A single dose BLM was intratracheally injected to induce pulmonary fibrosis in rats, so as to observe the changes of tissue hydroxyproline and oxidativestress markers during the process. The animals were killed on the 3rd, 7th, 14th and 28th d separately. The pathological model was evaluated by HE and Masson dyeing method, and the hydroxyproline of lung tissue was determined. At the same time, malonaldehyde (MDA) content, superoxide dismutase (SOD) activity, reduced glutathione/oxidized glutathione (GSH/GSSG) ratio of lung tissue were also detected. RESULTS: From 7 d to 28 d, the hydroxyproline of lung tissue was increased in BLM groups compared with that in control groups, especially on the 28th d (P<0.05). On the 7 d and14 d, the tissue MDA were enhanced while the activity of SOD was decreased compared with those of control (P<0.05). The GSH/GSSG ratio was lower than that of control on the 3 d and 7 d (P<0.05). CONCLUSION: Tissue hydroxyproline can be a marker of BLMinduced pulmonary fibrosis. The oxidationantioxidation disequilibrium of cells and matrix may play a role in the pathological process.
【Keywords】 pulmonary fibrosis; hydroxyproline; oxidativestress
【摘要】 目的：觀察博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中組織羥脯氨酸(Hyp)及各氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化，探討氧化抗氧化失衡在該病發(fā)生發(fā)展中的作用. 方法：二級(jí)SD大鼠40只，隨機(jī)分為模型組與對(duì)照組，每組20只. 氣管內(nèi)注入博萊霉素A5（BLMA5）溶液，建立肺纖維化模型. 分別于3，7，14和28 d每組隨機(jī)抽出5只，處死后取肺臟行HE, Masson染色鑒定模型并測(cè)定Hyp含量. 同時(shí)分別以八木國(guó)夫熒光法測(cè)定肺組織脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物（MDA）；改良鹽酸羥胺法測(cè)定組織總超氧化物歧化酶（SOD）的酶活力；改良熒光法測(cè)定還原型谷胱甘肽（GSH）含量；熒光法測(cè)定氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量. 并計(jì)算GSH/GSSG值. 結(jié)果：成功建立博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型. 各指標(biāo)在不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)變化. 模型組Hyp含量于7 d時(shí)高于對(duì)照組，28 d達(dá)到最高（P<0.05）. 模型組MDA含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，其中14 d時(shí)顯著高于對(duì)照組（P<0.05），但在28 d時(shí)有下降. SOD活力在7 d, 14 d均降低，28 d時(shí)上升. 模型組GSH/GSSG在3 d, 7 d顯著低于對(duì)照組（P<0.05），14 d, 28 d又回升. 結(jié)論：Hyp可作為博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的一個(gè)指標(biāo). 博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化伴有氧化損傷，且在不同階段細(xì)胞內(nèi)、外的氧化抗氧化出現(xiàn)失衡.
【關(guān)鍵詞】 肺纖維化；羥脯氨酸；氧化應(yīng)激
0引言
肺纖維化是一組由多種病因所引起的肺破壞性疾病,目前的治療方法尚不能改善其不良的預(yù)后，加強(qiáng)對(duì)肺纖維化機(jī)制的研究，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展新的`治療策略已成為更加迫切的現(xiàn)實(shí)需要. 一般認(rèn)為，在肺部，損傷組織及激發(fā)纖維化的主要病理機(jī)制在于炎癥和免疫反應(yīng)，但是大量研究表明，氧自由基在炎癥和免疫介導(dǎo)的組織損傷中扮演了重要角色［1］. 故本研究通過(guò)建立博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型，觀察各氧化指標(biāo)在此過(guò)程中的變化，從自由基理論的角度，深入探討氧化抗氧化失衡在該病發(fā)生發(fā)展中的重要作用.
1材料和方法
1.1材料
博萊霉素A5，天津太河制藥有限公司產(chǎn)品（批號(hào)：030305），8 mg/支. 丙二醛（MDA）標(biāo)準(zhǔn)品（Merk公司）;2Thiobarbituric acid（Merk公司）;磷鎢酸（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上�；瘜W(xué)試劑公司）;鹽酸羥胺（AR, 天津化學(xué)試劑一廠）;氯化硝基四氮唑藍(lán)，NBT，NEMI（華美公司）;Triton X100（上海試劑一廠）; 7210分光光度計(jì)(上海分析儀器廠虹橋分廠);970CRT熒光分光光度計(jì)（上海分析儀器總廠）;GL20A全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)（湖南儀器儀表離心機(jī)廠）.
二級(jí)SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量180~240 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供. 隨機(jī)分為模型組與對(duì)照組，每組20只.
1.2方法
1.2.1制備模型［2］以10 g/L戊巴比妥鈉（10 mg/kg, ip）麻醉大鼠，取仰臥固定位，常規(guī)消毒，行頸部正中切口，鈍型分離暴露氣管，于氣管軟骨環(huán)間隙穿刺注入BLMA5生理鹽水溶液0.2～0.3 mL（5 mg/kg），立即將動(dòng)物直立并行旋轉(zhuǎn)，縫合皮膚，待動(dòng)物自然清醒后置籠內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng). 對(duì)照組(假手術(shù)組)以等容量生理鹽水(NS)注入氣管代之.
1.2.2模型鑒定分別于氣管內(nèi)滴藥后第3，7，14和28日處理. 每批每組隨機(jī)抽出5只，麻醉處死. ①剖開胸腔及頸部，分離氣管和肺臟，結(jié)扎后取出肺臟，洗去血漬，去除結(jié)締組織，吸干水分；②從氣管插管至左主支氣管，結(jié)扎固定. 分離結(jié)扎右主支氣管后離斷，取右上葉置體積分?jǐn)?shù)為40 g/L甲醛中固定1 wk，行HE和Masson染色［3］.
1.2.3肺臟羥脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)含量測(cè)定參考楊陟華等［4］的方法，將肺組織樣品剪碎，置于磨口試管中，用6 mol/L HCl (W∶V＝1∶4)水解(125℃) 3 h后，稀釋至10 mL，過(guò)濾. 取濾液0.1 mL(空白管和標(biāo)準(zhǔn)管分別用蒸餾水和標(biāo)準(zhǔn)Hyp代替)加蒸餾水到1.0 mL，充分氧化，加入0.5 mL檸檬酸緩沖液(0.25 mol/L，pH 6.0)和1.0 mL氯胺T溶液(0.05 mol/L)后6 min，用過(guò)氯酸(3.15 mol/L，1.0 mL)終止反應(yīng)(靜置5 min). 加入100 g/L PDMAB 1.0 mL，于80℃水浴中保溫10 min，顯色完全后，自來(lái)水(25℃)冷卻5 min. 最后用7210分光光度計(jì)在560 nm波長(zhǎng)比色，測(cè)量其吸光度A值，用下式計(jì)算Hyp含量：肺組織Hyp含量(mg/g)＝(0.5×A樣/A標(biāo))／m. 其中，A樣為樣品管吸光度，A標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度，m為肺重.
1.2.4氧化損傷指標(biāo)的測(cè)定剪取左肺，稱質(zhì)量，按1∶5加入生理鹽水制備勻漿. 3000 r/min離心10 min，取上清，凍存?zhèn)溆? 分別以八木國(guó)夫熒光法［5］測(cè)定肺組織脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物（MDA）；改良鹽酸羥胺法［6］測(cè)定組織總SOD的酶活力；改良熒光法［7］測(cè)定還原型谷胱甘肽（GSH）；熒光法［7］測(cè)定氧化型谷胱甘肽(GSSG). 并計(jì)算GSH/GSSG值.
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)均以x±s表示. 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析，采用成組t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)用t′檢驗(yàn). P<0.05為有顯著性差異.A: Control groupHE ×100; B: BLM groupHE ×100; C: Control groupMasson ×100; D: BLM groupMasson ×100.
2結(jié)果
2.1大體形態(tài)觀察對(duì)照組雙肺呈粉紅色，表面光滑，彈性良好. 模型組3 d未見有明顯改變，而7 d見雙肺有點(diǎn)狀出血、灶狀瘀斑. 14 d雙肺色澤暗淡，局部見大小不等結(jié)節(jié)樣改變，仍有陳舊出血點(diǎn). 28 d雙肺呈灰白色，硬度增加，體積縮小. 表面有條索樣凹溝.
2.2光鏡觀察對(duì)照組各觀察點(diǎn)均未出現(xiàn)明顯病變. 模型組3 d時(shí)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等急性肺泡炎改變；7 d時(shí)肺泡間隔增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞開始增多；14 d時(shí)肺泡炎仍較重，纖維組織進(jìn)一步增加；28 d炎癥較前減輕，肺纖維化程度加重，部分肺泡腔消失，為大量膠原纖維、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞所占據(jù)(Fig 1).
2.3肺臟Hyp含量（Fig 2）模型組Hyp含量于7 d時(shí)高于對(duì)照組，28 d達(dá)到最高（P<0.05）.
2.4肺組織勻漿MDA含量、SOD活力、GSH/GSSG比值變化（Tab 1~3）各指標(biāo)在不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)變化. 模型組MDA含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，其中14 d時(shí)顯著高于對(duì)照組（P<0.05），但在28 d時(shí)有下降. SOD活力在7 d和14 d均降低，28 d時(shí)上升. 模型組GSH/GSSG在3 d和7 d顯著低于對(duì)照組（P<0.05），14 d和28 d又回升.表1兩組大鼠肺組織勻漿MDA含量變化（略）表2兩組大鼠肺組織勻漿SOD活力變化（略）表3兩組大鼠肺組織勻漿GSH/GSSG比值變化（略）
3討論
活性氧（ROS, Reactive oxygen species） 如超氧陰離子及過(guò)氧化氫是多種疾病的重要介質(zhì)，包括肺纖維化. 在正常的生理?xiàng)l件下，自由基引發(fā)的組織損傷可被內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)所抑制. 然而，當(dāng)這些抗氧化物不足以對(duì)抗大量的氧化物即氧化抗氧化系統(tǒng)失衡時(shí)，組織就會(huì)發(fā)生不可逆性損傷［8］. 博萊霉素與鐵離子反應(yīng)可以產(chǎn)生ROS從而損傷蛋白、脂質(zhì)和DNA，其誘導(dǎo)的肺纖維化包括兩個(gè)階段. 早期的炎癥階段，大量的炎性細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)到間質(zhì)或肺泡中［9］. 在隨后發(fā)生的纖維化階段，炎癥細(xì)胞轉(zhuǎn)移到肺部后，因被激活釋放過(guò)量的氧自由基，除直接引起肺組織的脂質(zhì)過(guò)氧化，啟動(dòng)PF前的炎癥反應(yīng)，尚可能通過(guò)激活核因子κB(NFκB)上調(diào)細(xì)胞因子的產(chǎn)量，間接促進(jìn)纖維化的形成［10］；同時(shí)，肺纖維化的動(dòng)物模型或患者中抗自由基的保護(hù)系統(tǒng)功能也有所降低. 據(jù)此，提出抑制自由基的產(chǎn)生，清除已產(chǎn)生的自由基及加強(qiáng)抗自由基系統(tǒng)的策略.
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用博萊霉素復(fù)制大鼠肺纖維化模型，觀察發(fā)現(xiàn)7 d時(shí)肺泡炎明顯，28 d形成纖維化，且模型組28 d時(shí)羥脯氨酸含量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）. 主要病變與指標(biāo)都與文獻(xiàn)一致，說(shuō)明動(dòng)物模型復(fù)制成功. Hyp是機(jī)體膠原蛋白的主要成分之一，約占其氨基酸總量的13%,其他除彈性蛋白含有少量Hyp(約1%)外，均不含Hyp. 因此組織中Hyp含量可作為其膠原組織代謝的重要指標(biāo)［11］. 本研究還發(fā)現(xiàn)作為體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化指標(biāo)的MDA 14 d時(shí)與對(duì)照相比較顯著增高（P<0.05），而GSH/GSSG比值在3 d和7 d時(shí)有顯著降低，其他時(shí)間組未見明顯變化. 對(duì)照組、模型組總SOD活力在7 d和14 d時(shí)都有所降低. 以上結(jié)果提示，肺組織氧化與抗氧化指標(biāo)在不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)不同的變化，作為細(xì)胞內(nèi)最豐富的抗氧化劑，GSH在細(xì)胞清除ROS過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，尤其在肺纖維化早期炎癥階段大量耗竭；MDA含量和SOD活力在纖維化階段有所變化，推測(cè)在成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖并分泌大量膠原的過(guò)程中，SOD可能發(fā)揮一定抑制作用. 而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，胞外SOD是肺組織的主要抗氧化劑，它分布于細(xì)胞表面及胞外基質(zhì)中，對(duì)于保護(hù)肺泡細(xì)胞及抑制基質(zhì)的過(guò)度重建有重要作用［11］. 因此，研究如何調(diào)控細(xì)胞基質(zhì)細(xì)胞間氧化/抗氧化系統(tǒng)的平衡等肺纖維化的發(fā)生機(jī)制，為防治肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展提供新的思路.
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