梔子的化學(xué)成分及抗白血病活性研究

時間：2020-10-06 13:40:21 藥學(xué)畢業(yè)論文我要投稿

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梔子的化學(xué)成分及抗白血病活性研究

　　【摘要】目的闡明梔子Gardenia jasminoides Ellis中抗急性淋巴細(xì)胞白血病的活性成分。方法用色譜方法分離梔子中化學(xué)成分，用波譜技術(shù)(IR，ESI?MS，1H?NMR，13C?NMR)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，用四唑鹽(MTT)比色法測定化合物對白血病細(xì)胞（HL?60?人早幼粒細(xì)胞白血病、REH?人急性淋巴細(xì)胞白血病、 Raji?淋巴瘤）增殖的影響。結(jié)果分離鑒定了8個化合物：β?谷甾醇（1），5?羥基?7，3′，4′，5′?四甲氧基黃酮（2），熊果酸（3），D?甘露醇（4），梔子苷（5），去乙酰車葉草甙酸甲酯（6），京尼平?1?β?龍膽苷（7），雞矢藤次苷甲酯（8）。化合物3對3種白血病細(xì)胞增殖均表現(xiàn)出了一定的抑制作用，其中對REH細(xì)胞系抑制活性最強，IC50為7.5 μg/mL。結(jié)論化合物3具有抗急性淋巴細(xì)胞白血病的作用。

　　【關(guān)鍵詞】梔子急性淋巴細(xì)胞白血病活性成分四唑鹽比色法

　　Abstract:Objective To determine the active constituents from Gardenia jasminoides against acute lymphoblastic leukemia. Methods Compounds were isolated and purified by various column chromatographic techniques and their structures were elucidated on the basis of spectral analysis (IR, ESI?MS, 1H?NMR, 13C?NMR). The inhibitory activity against the proliferation of HL?60, REH and Raji cell lines was determined by using MTT assay．Results Eight compounds were isolated and identified as β?sitosterol (1)，5?hydroxy?7，3′，4′，5′?tetramethoxyflavone (2)，Ursolic acid (3), D?mannitol (4)，geniposide (5), deacetylasperulosidic acid methyl ester(6), genipin?1?β?gentiobioside (7) and scandoside methyl ester (8). Compound 3 exhibited inhibitory effects on leukemic cell proliferation in vitro with IC50 of 12.2, 7.5 and 15.4 μg/mL aginst HL?60, REH and Raji cell lines, respectively．Conclusion Ursolic acid might be one of the active ingredients against anti-acute lymphoblastic leukemia conferred by Gardenia jasminoides Ellis.

　　Key words:Gardenia jasminoides Ellis；acute lymphoblastic leukemia；active constituents；MTT assay

　　1），5?羥基?7，3′，4′，5′?四甲氧基黃酮（2），熊果酸（3），D?甘露醇（4），梔子苷（5），去乙酰車葉草甙酸甲酯（6），京尼平?1?β?龍膽苷（7），雞矢藤次苷甲酯（8），其中熊果酸對白血病細(xì)胞增殖表現(xiàn)較強的抑制作用。

　　1 儀器與材料

　　Fisher?Johns熔點儀（未校正），SHIMADZU FTIR?8400S紅外光譜儀，Bruker AM 500型核磁共振儀， Thermo Scientific LTQ Orbitrap質(zhì)譜儀，上海亞榮旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE 2000，SpectraMax 190酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)，薄層板和硅膠（青島海洋化工廠），Sephadex LH?20為Pharmacia產(chǎn)品，其他試劑均為分析純（MTT,美國Sigma公司）。

　　細(xì)胞株：HL?60?人早幼粒細(xì)胞白血病、REH?人急性淋巴細(xì)胞白血病、Raji?淋巴瘤（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所）

　　梔子樣品于2008年3月購自北京同仁堂京北康大家園藥店，經(jīng)林余霖研究員鑒定為梔子Gardenia jasminoides Ellis。植物標(biāo)本存放于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所標(biāo)本館，編號為R?001。

　　2 方法

　　2．1 提取與分離

　　焦梔子（1 kg）經(jīng)過粉碎，用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇回流提取3次，每次2 h，提取液減壓濃縮得浸膏100 g，稱取硅膠(100～200目)210 g拌樣，上硅膠色譜柱,用三氯甲烷?甲醇（體積比100∶1～0∶100）洗脫：三氯甲烷?甲醇（體積比95∶5）洗脫部分可得到化合物1（15 mg）、化合物2（6 mg）、化合物3（18 mg）；三氯甲烷?甲醇（體積比9∶1～8∶2）洗脫得化合物5（1 853 mg）、化合物6（9 mg）、化合物7（8 mg）；三氯甲烷?甲醇（體積比7∶3）洗脫得到化合物8（10 mg）；三氯甲烷?甲醇（體積比6∶4）洗脫得到化合物4（120 mg）。

　　2.2 活性篩選

　　粗提物、各組分及化合物以二甲基亞砜（DMSO）溶解，配成50 mg·mL-1的儲備液，-20 ℃保存。臨用時用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI?1640培養(yǎng)液稀釋，配制所需濃度（終濃度樣品中DMSO含量<0.1%）。取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞2×105個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100 μL,設(shè)不同濃度的細(xì)胞組、空白對照組、調(diào)零組，至終體積為200 μL，每組設(shè)6個復(fù)孔。接種后，于37 ℃、5% CO2中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT（5 mg·mL-1）20 μL，孵育4 h后，1 000 r/min離心5 min,小心吸棄培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，充分溶解MTT。酶標(biāo)儀測定各孔吸光度（A值），其中測定波長為570 nm，校正波長為650 nm。計算生長抑制率。

　　生長抑制率=給藥組A值-調(diào)零組A值細(xì)胞空白對照組A值-調(diào)零組A值×100%3 結(jié)果與討論

　　3．1 結(jié)構(gòu)鑒定

　　化合物1:無色片狀晶體（三氯甲烷），mp 142～143 ℃。EI?MS m/z：414(M+)，與文獻(xiàn)［3］報道數(shù)據(jù)一致；與對照品β?谷甾醇共薄層層析，兩者的Rf值、斑點顏色完全一致。鑒定為β?谷甾醇。

　　化合物2:無色針晶(石油醚)，1H?NMR(500 MHz，CDCl3) δ：3.96［6H，s，(CH3)2 C3′, C5′?OCH3］，3.93(3H，s，C7?OCH3)，3.89(3H，s，C4′?OCH3), 6.38(1H，d，C8?H)，6.50(1H，d， C6?H)，6.60(1H，br s， C3?H)，7.08(2H，s，C2′?H，C6′?H)，12.72(1H，br s，C5?OH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］報道一致，確定為5?羥基?7，3′，4′，5′?四甲氧基黃酮。

　　化合物3: 白色結(jié)晶，mp 269～270 ℃。13C?NMR(DMSO?d6)δ: 38.3(C?1)，23.7(C?2)，76.7(C?3)，38.3(C?4)，52.3(C?5)，21.0(C?6)，32.6(C?7)，38.4(C?8)，46.7(C?9)，38.1(C?10)，24.0(C?11)，124.5(C?12)，138.1(C?13)，41.6(C?14)，30.1(C?15)，21.0(C?16)，46.9(C?17)，54.7(C?18)，28.2(C?19)，27.5(C?20)，26.9(C?21)，36.2(C?22)，22.8(C?23)，16.9(C?24)，16.0(C?25)，15.1(C?26)，23.7(C?27)，178.2(C?28)，21.2(C?29)，23.2(C?30)。上述數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［5］報道一致，與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行薄層層析對照，Rf值一致，鑒定為熊果酸。

　　化合物4:無色針狀結(jié)晶，mp 167 ℃。ESI?MS m/z： 181［M?H］-。 IR (KBr)cm-1： 3 260， 2 940，

　　1 470，1 105，1 030。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］報道一致。13C?NMR(DMSO?d6) δ：71.3(C?2,5)，69.6(C?3,4)，63.8(C?1,6),綜上所述鑒定為D?甘露醇。

　　化合物5: 白色粉末(三氯甲烷)，mp 163～164 ℃。ESI?MS m/z：411［M+Na］+。1H?NMR(500 MHz，DMSO?d6 ) δ：7.45(1H，s，H?3)，5.66(1H，brs， H?7)，5.11(1H，d，J=6.8Hz，H?1)，3.66(3H，s，COOCH3),4.14(q，2H，H?10a，10b)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［4］報道一致，確定為梔子苷。

　　化合物6: 無色粉末（甲醇）。ESI?MS m/z：427 (M++Na)，1H?NMR(500 MHz，DMSO?d6) δ：7.56(s，H?3)， 5.87(s，H?7)，4.92(d，J=8.5 Hz,H?1)，4.56(d，J=8 Hz， H?1′)， 4.27(q，2H，H?10a，10b)， 3.1～3.4(m, 4H，H?2′，4′，3′，5′ )。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6,8］報道基本一致，鑒定為去乙酰車葉草苷酸甲酯。

　　化合物7:無色粉末（甲醇）。ESI?MS m/z：573 (M++Na)，1H?NMR(500 MHz，DMSO?d6)δ：7.46(s，H?3)， 5.69(s，H?7)，5.11 (d,J=5.5 Hz,H?1),5.0(d，J=7 Hz，H?1′)，4.14(q，2H，H?10a，10b)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報道基本一致，鑒定為京尼平?1?β?龍膽苷。

　　化合物8:無色粉末（甲醇）。1H?NMR(500 MHz，DMSO?d6)δ：7.35(s，H?3)， 5.64(s，H?7)，5.27(d，H?1)，4.45(d，J=8 Hz， H?1′)， 4.11(q，2H，H?10a，10b)， 3.1～3.4(m, 4H，H?2′，4′，3′，5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6,8］報道基本一致，鑒定為雞矢藤次苷甲酯。

　　3.2 活性篩選結(jié)果

　　活性篩選結(jié)果（見表1）顯示，化合物3(熊果酸) 對3種白血病細(xì)胞增殖均表現(xiàn)出了一定的抑制作用，其中對REH細(xì)胞系抑制活性最強，IC50為7.5 μg/mL。

　　表1 化合物對3種白血病細(xì)胞增殖的抑制作用（略）

　　Table 1 IC50 (50%Inhibitory concentration) of compounds from Gardenia jasminoides Ellis against three different leukemic cell linesIC50/

　　有關(guān)熊果酸對急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的抑制作用此前未見文獻(xiàn)報道。本文結(jié)果表明，梔子提取物中抑制細(xì)胞增殖的活性成分主要在低極性部位，水溶性部分沒有顯示細(xì)胞抑制作用。在分離的得到的化合物中，三萜類成分熊果酸顯示出了較強的體外活性，對3種白血病細(xì)胞均有一定的抑制作用，尤其對急性淋巴細(xì)胞白血病REH細(xì)胞株有較強的.抑制作用；而其他化合物均沒有細(xì)胞抑制作用（IC50值大于160 μg·mL-1）。

　　民間治療急性淋巴細(xì)胞白血病通常是取30～40個焦梔子加水煎湯。30～40個梔子大約25～35 g，熊果酸在梔子中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為0.03%～0.04%［9］，相當(dāng)于約100 mg左右熊果酸的用量，這一用量可在體內(nèi)一定程度上達(dá)到抑制白血病細(xì)胞增殖的起效劑量。因此，熊果酸可能為梔子治療急性淋巴細(xì)胞白血病的一個活性成分。當(dāng)然，梔子中其他成分在治療急性淋巴細(xì)胞白血病中發(fā)揮的作用及其機制可能也不可忽略，例如雖然本文中水溶性部分沒有顯示直接的抑制白血病細(xì)胞增殖的活性，但文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)梔子多糖具有比較廣譜的體內(nèi)抑瘤效應(yīng)［11-12］，梔子中環(huán)烯醚萜有機酸酯類成分具有抗氧化和抗炎活性［12］，這些活性作用可能對急性淋巴細(xì)胞白血病的治療也發(fā)揮一定的輔助作用。